本发明专利技术涉及一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，首先进行斑马鱼胚胎样本前处理，然后在胚胎中加入裂解缓冲液，用广口枪头在冰浴中裂解胚胎，立即进行转座反应并纯化DNA，然后通过实时荧光定量的方法确定建库用的循环数，直接通过一步PCR的方法进行建库测序。ATAC-seq和DNase-seq两种方法都能够对基因组染色质上调控序列进行定位和解读，但ATAC-seq步骤更为简单，需要的细胞也更少，在无法获得大量细胞的情况下，ATAC-seq更有帮助，且根据实验结果ATAC-seq获得的数据富集程度更高。本发明专利技术还将其应用到斑马鱼胚胎细胞中，对于研究生物体早期发育过程中的染色质结构的变化及相应的基因表达调控研究提供一种有效且简单的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学实验
，尤其适用于斑马鱼早期胚胎发育过程中染色质结构的变化及基因表达调控机制研究。
技术介绍
越来越多的证据显示，许多遗传学差异并非影响基因，而是改变控制基因开/关的调控序列。活化的调控序列上结合有转录因子，转录因子是识别特定DNA序列的蛋白。一旦转录因子结合，就会招募其他蛋白，使附近的基因开始转录。在指定细胞中鉴定所有活跃的调控序列，对于理解基因组的作用机制非常重要。易接近转座酶核染色质高通量测序实验(Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing，ATAC-seq)，通过Tn5转座酶，优先标记和测序核小体之间的DNA，获取全基因组上转录因子和核小体定位信息，其提供的信息与DNase-seq法差不多，但步骤更为简单，需要的细胞也更少。在无法获得大量细胞的情况下，ATAC-seq更有帮助。例如，在胚胎发育早期细胞量少，收集大量细胞难度大，成本高，用ATAC-seq检测早期胚胎发育过程中染色质的开放变化及转录因子结合序列，为研究基因表达调控提供依据。也可以在癌症组织或ips生成的细胞中，用ATAC-seq检测调控序列，此外，ATAC-seq也有望成为有用的诊断工具。斑马鱼由于养殖方便，繁殖周期短，产卵量大，胚胎体外受精，体外发育，胚胎透明，研究发现斑马鱼共享了人类70%的蛋白编码基因，而且人类相关基因中有84%可以在斑马鱼中找到对应基因，已成为生命科学研究的新宠。利用斑马鱼可以研究生命科学的基础问题，揭示斑马和组织器官发育的分子机理;可以构建人类的各种疾病和肿瘤模型，建立药物筛选和治疗的研究平台等。目前ATAC-seq技术只是用于细胞样本中，还未有报道在斑马鱼的胚胎细胞中应用。本方法针对斑马鱼胚胎进行了改良，以利于对胚胎发育过程中染色质结构的变化及与基因表达的关系进行研究，为揭开人类发育的神秘面纱提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了研究斑马鱼早期胚胎发育过程中的染色质开放的变化及与基因表达调控的关系所建立的一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现:—种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，该方法包括以下步骤:(1)斑马鱼胚胎样本的准备:取斑马鱼胚胎于离心管中，加预冷的PBS洗涤剂洗涤3次；(2)斑马鱼胚胎细胞核获取:加入预冷的裂解缓冲液200ul(10mMTris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，3mM MgC12，0.1% IGEPAL CA-630)，用200ul广口的移液器枪头冰上反复吹打，直至胚胎完全裂解，4度，转速500g，10min离心收集细胞核。(3)转座反应和纯化:立即加Tn5转座酶及TD转座缓冲液进行转座反应，轻轻涡旋后短暂离心，37度水浴反应30min。转座反应具体包含:25ul 2*TD Buffer，2.5ul Tn5转座酶，22.5ul无核酶水(Illumina Cat#FC-121-1030)。转座结束后用QiagenMinEluteKit 进行纯化，10ul洗脱液洗脱，纯化后的DNA可于-20度保存；(4)PCR 扩增:第一次PCR反应，步骤(3)所得纯化10ul转座纯化后DNA，加9.7ul无核酶水，2.5ul25uMCustomized Nextera PCR Primerl，2.5ul 25uMCustomized Nextera PCR Primer2(Barcode),0.3ul 100*SYBR Green I，25ul NEBNext High-Fidelity 2*PCR Master Mix。具体反应条件为72°C5min，98°C30sec，98°C10sec，63°C30sec，72°Clmin，Repeat steps 3-5，4cycles，保持在4°C ；第二次PCR反应体系包括:5ul第一次PCR反应产物，4.44ul无核酶7jC，0.25ul 25uMCustomized Nextera PCR Primerl，0.25ul 25uMCustomized NexteraPCR Primer2(Barcode),0.06ul 100*SYBR Green I，5ul NEBNext High-Fidelity 2*PCRMaster Mix。具体反应条件为98°C30sec，98°C10sec，63°C30sec，72°Clmin，Repeat steps2-4，19cy c 1 es，保持在4°C。剩下的45u 1反应液于冰上放置备用；(5)文库构建及纯化:根据实时荧光定量PCR结果来确定文库构建所有反应的循环数。实时荧光定量曲线图线性化设置(Rn/Cycle)，RF阈值设为5000，循环数的计算为1/4最大荧光值所对应的循环数为该样本建库所需要的循环数。根据计算结果将步骤(4)剩下的45ul样品放入PCR仪中反应，PCR反应条件为98°C30sec，98°C10sec,63°C30sec，72°Clmin，Repeat steps 2-4,xcycles，保持在4°C。所得文库用AMPure beads纯化后，通过b1analyzer进行文库质量检测，HiSeq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。ATAC-seq和DNase-seq两种方法都能够对基因组染色质上调控序列进行定位和解读，但ATAC-seq步骤更为简单，需要的细胞也更少，在无法获得大量细胞的情况下，ATAC_seq更有帮助，且根据实验结果ATAC-seq获得的数据富集程度更高。本专利技术还将其应用到斑马鱼胚胎细胞中，对于研究生物体早期发育过程中的染色质结构的变化及相应的基因表达调控研究提供一种有效且简单的方法。【具体实施方式】本专利技术方法，首先进行斑马鱼胚胎样本前处理，然后在胚胎中加入裂解缓冲液，用广口枪头在冰浴中裂解胚胎，立即进行转座反应并纯化DNA，然后通过实时荧光定量的方法确定建库用的循环数，直接通过一步PCR的方法进行建库测序。下面结合具体实施例对本专利技术技术方案进行详细说明。实施例收取成功受精的斑马鱼早期胚胎样品。具体方法如下:(1)斑马鱼胚胎样本的准备:取64细胞期，256细胞期，lk细胞期，Oblong细胞期，Dome/30%epiboly细胞期斑马鱼胚胎于离心管中，加预冷的PBS洗涤剂洗涤3次；(2)斑马鱼胚胎细胞核获取:加入预冷的裂解缓冲液200ul(10mMTris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，3mM MgC12，0.1% IGEPAL CA-630)，用200ul广口的移液器枪头冰上反复吹打，直至胚胎完全裂解，4度，转速500g，10min离心收集细胞核。(3)转座反应和纯化:立即加Tn5转座酶及TD转座缓冲液进行转座反应，轻轻涡旋后短暂离心，37度水浴反应30min。转座反应具体包含:25ul 2*TD Buffer，2.5ul Tn5转座酶，22.5ul无核酶水(Illumina Cat#FC-121_1030)。转座结束后用QiagenMinElute Kit进行纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC‑seq)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)斑马鱼胚胎样本的准备：取斑马鱼胚胎于离心管中，加预冷的PBS洗涤剂洗涤3次；(2)斑马鱼胚胎细胞核获取：加入预冷的裂解缓冲液200ul，用200ul广口的移液器枪头冰上反复吹打，直至胚胎完全裂解，离心收集细胞核；(3)转座反应和纯化：立即加Tn5转座酶及TD转座缓冲液进行转座反应，轻轻涡旋后短暂离心，37度水浴反应30min；转座结束后用Qiagen MinElute Kit进行纯化，10ul洗脱液洗脱，纯化后的DNA可于‑20度保存；(4)PCR扩增：步骤(3)所得纯化DNA转入0.1mlPCR管中，加入上下游PCR引物，SYBR GreenI，PCR Master Mix，PCR仪器中反应4个循环；上述反应液取出5ul，依次再加入上述引物等，在实时荧光定量PCR仪中反应19个循环，剩下的45ul反应液于冰上放置备用；(5)文库构建及纯化：根据实时荧光定量PCR结果来确定文库构建所有反应的循环数；实时荧光定量曲线图线性化设置(Rn/Cycle)，RF阈值设为5000，循环数的计算为1/4最大荧光值所对应的循环数为该样本建库所需要的循环数；根据计算结果将步骤(4)剩下的45ul样品放入PCR仪中反应，所得文库用AMPure beads纯化后，通过bioanalyzer进行文库质量检测，Hiseq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘桂芬，张勇，王璐莹，霍霄，赵程辰，王文，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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