一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法技术

本发明专利技术公开了一株乳酸片球菌PA003(Pediococcus acidilactici PA003)与片球菌素同步生产的方法。利用解析附片球菌素、离心将发酵液中的片球菌素与乳酸片球菌菌体分开，然后经过微滤、超滤、纳滤、冷冻干燥获得片球菌素产品，经喷雾干燥获得乳酸片球菌菌体。其中乳酸片球菌喷干制剂的活菌数可达到8.5×1012-8.6×1012CFU/g，存活率为20-25％。片球菌素产品的纯化倍数为2.5％-2.6％以上，收率可达到80％-85％。为实现同时获得乳酸片球菌制剂及其片球菌素产品提供了依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种片球菌素生产方法，特别涉及乳酸片球菌与片球菌素同步生产的 方法。
技术介绍
在控制食品中病原性和腐败性微生物方面，一个重要的发展就是细菌素的发现。 细菌素为肽类物质，由细菌产生，在食品工业上，细菌素指的是由乳酸菌产生，对许多腐 败和病原细菌有杀灭作用。因为他们符合公认安全的标准（Generallyrecognizedas safe，GRAS)，因此，具有作为食品保藏剂的巨大潜力。乳酸菌产生的细菌素对食品工业有极 强的吸引力，还因为他们属于天然食品防腐剂，使用这些抗菌肽可以大大减少化学添加剂 的使用量或减少物理处理的强度。 到目前为止，nisin(乳链球菌素）是唯一得到商业化和大规模应用的细菌素。尽 管nisin具有抗菌谱较广、天然、无毒副作用、安全、高效等优点，但其在在中性和碱性条件 下溶解度低，对食品中一些酶敏感，及一些细菌可对其产生抗性等问题。因此，对于仅单独 用一种细菌素贮藏的食品，抗细菌素的病原微生物的出现是潜在的威胁。克服这些问题的 途径之一是开发更多的细菌素，并将多种细菌素联合应用，以弥补使用单一细菌素可能出 现的问题。片球菌素被认为是继nisin之后第二个有望用于食品工业的细菌素。主要因为 它由符合GRAS标准的片球菌产生，具有广谱抑菌作用，在食品中性质稳定，进入消化道后 迅速被蛋白酶消化等特征。 乳酸片球菌能够定居到动物和人的消化道，作为潜在的益生菌显示出良好的应用 前景。目前乳酸片球菌作为益生菌的应用主要集中在小动物、禽类、猪和水产动物等，正被 作为益生制剂用于治疗便秘、腹泻、消除应激反应、增强免疫力等。乳酸片球菌作为益生菌 制剂代替抗生素用于饲料中是国际上备受推崇的措施之一，具有良好的市场前景。 现有的片球菌素纯化方法，都较为繁琐，大量纯化成本也较高。且在纯化的过程中 只提取片球菌素，而乳酸片球菌则在纯化的过程中死亡而未被收集利用。乳酸片球菌有很 多益生作用，在发酵过程中不能够收集应用是一种浪费。因此建立获得乳酸片球菌菌体和 片球菌素的同步生产工艺具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种乳酸片球菌与片球菌素同步生 产的方法，克服现有技术中片球菌素纯化方法繁琐、成本较高、乳酸片球菌在纯化的过程中 未被收集利用的问题。 本专利技术的技术方案是：，包括以下步 骤： (1)将含有乳酸片球菌和片球菌素的发酵液调节pH为2. 8-3. 2,搅拌进行解吸 附； (2)将步骤（1)解吸附的发酵液离心处理，得到上清液和菌体； (3)将步骤（2)所得上清液依次经过微滤、超滤、纳滤、冷冻干燥工艺获得片球菌 素产品； (4)将步骤（2)所得菌体进行喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂。 所述步骤（1)搅拌解吸附速率为200r/min，时间2h。 所述步骤⑵离心的条件为4°C，lOOOOrpm。 所述步骤⑶微滤的条件为0.45 μ m水系微滤膜，室温，压力为0· IMpa。 所述步骤（3)超滤工艺的条件为：选择截留分子量为5000Da的聚醚砜膜，在室温， 0. 02MPa的条件下进行超滤处理，超滤浓缩比为3时，进行洗滤操作，加入与初始料液等体 积的去离子水进行全过滤工艺，待超滤浓缩比为5时停止超滤处理。 所述步骤（3)纳滤工艺的条件为：选择截留分子量为650Da的聚醚砜膜，在室温， 0. 02MPa的条件下进行纳滤处理，纳滤浓缩比为4时停止纳滤浓缩。 所述步骤（3)冷冻干燥获得片球菌素产品工艺为：将纳滤浓缩液中加入一定量的 氯化钠，最终浓度为70% -80%，首先-45°C预冻2h，温度为-56°C，干燥6h。 所述步骤⑷喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂工艺为：保护剂为海藻 糖 48-52g/L，β-环糊精 28-32g/L，乳糖 38-42g/L，脱脂乳粉 98-102g/L;进 口温度 145-155°C，进料流速为65-75mL/h，保护剂与菌泥的比例为0. 235-0. 245(L:g)。 本专利技术的有益效果为：本专利技术同步生产方法同时获得了乳酸片球菌菌体和片球 菌素产品。乳酸片球菌喷干制剂的活菌数可达到8. 5X1012-8. 6X1012CFU/g，存活率为 20-25%。片球菌素产品的纯化倍数为2. 5% -2. 6 %以上，收率可达到80% -85%。【附图说明】 图1乳酸片球菌素效价标准曲线；抑菌圈直径差：不同浓度的片球菌素溶液与中 心浓度（片球菌素溶液与PBS缓冲液1:1混合，效价为320AU/mL)的片球菌素溶液抑菌圈 直径的差值； 图2乳酸片球菌菌体和片球菌素同步生产工艺流程图。【具体实施方式】 下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术做详细说明。 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 海藻糖购自南宁中诺生物工程有限责任公司，谷氨酸钠购自国药集团化学试剂有 限公司、α-乳糖购自上海恒信化学试剂有限公司、β-环状糊精购自西安宏昌药业有限责 任公司、脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司。 5000Da和650Da聚醚砜超滤滤膜，美国Pal1公司；小型喷雾干燥机，美国 Labplant公司。 本专利技术中所述乳酸片球菌是指乳酸片球菌PA003 (Pediococcus acidilactici PA003)〇 实施例1 片球菌素效价测定 乳酸片球菌发酵液用2mol/L的HCI调节pH到1. 9-2. 0,防止乳酸片球菌素吸附 到细胞上，65-70°C水浴28-30min，防止发酵液中的蛋白酶破坏细菌素。然后，8000r/min， 4°(：离心15-2〇11^11，取上清液用2111〇1/1的似0!1调节？!1到5.9-6.1，进行抑菌试验测定乳酸 片球菌素效价。乳酸片球菌素的抑菌活性实验参考管碟法。效价的测定采用二倍稀释法， 以李氏杆菌为指示菌，细菌素液依次用0. 02mol/L，pH6. 0的磷酸缓冲液（PBS)2倍稀释，用 对指示菌显示抑菌圈的最高稀释倍数表示细菌素活性，计算式为：AU/mL= 2nX(1000/x)，n 表示对指示菌显示抑菌圈的大小与牛津杯外径的差值不小于2mm的孔数；x表示每孔中的 细菌素液加样体积。二倍稀释法确定了乳酸片球菌培养16-17h后发酵液中乳酸片球菌素 的效价为640AU/mL，抑菌圈直径差与效价对数值呈线性关系，可绘出效价标准曲线（见图 1)〇 实施例2 发酵后乳酸片球菌上吸附的片球菌素含量分析 乳酸片球菌培养16h后，发酵液分别进行如下处理：（1)发酵液离心（8000r/min， 4°C，lOmin)，上清液用4mol/LHCI调pH为2. 0,置于4°C冰箱备用，收集菌体备用；（2)上 述离心后的菌体2次洗涤后，加入发酵液等体积的100mm〇l/LNaCl(pH2. 0)，电动搅拌12h， 取上清液备用；（3)发酵液不离心直接用4mol/LHCI调pH为2. 0,电动搅拌搅拌12h，取上 清液备用；（4)发酵液用 4mol/LHCI调pH为 2. 0, 70°C，30min灭酶，离心（8000r/min，4°C， lOmin)取上清液，置于4°C冰箱中保存备用。 发酵结束后菌体细胞上吸附的片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将含有乳酸片球菌和片球菌素的发酵液调节pH为2.8‑3.2，搅拌进行解吸附；(2)将步骤(1)解吸附的发酵液离心处理，得到上清液和菌体；(3)将步骤(2)所得上清液依次经过微滤、超滤、纳滤、冷冻干燥工艺获得片球菌素产品；(4)将步骤(2)所得菌体进行喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周志江，韩烨，肖华志，王静，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12