本发明专利技术涉及一种枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及其在增强植物耐盐碱能力方面的应用。通过提取新鲜枸杞叶片中的总RNA，利用3’RACE方法克隆枸杞中的有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因LmMAPKK，得到基因完整的序列为1074bp；构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK，通过大肠杆菌异源表达系统，得到了39KD大小的LmMAPKK表达蛋白；并构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，通过测试，发现转基因烟草对盐碱、低温及病原菌侵染的抗性大大提高，对玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花等农作物；月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰等花卉；杨树、香花槐等乔木类树木转基因，发现其转基因植株耐盐碱能力大大提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种构杞化托扣曲紐如ease 中有丝分裂原活化蛋白激酶激 酶及其在增强植物耐盐碱能力方面的应用，具体为构杞中有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基 因（LmMAP邸）的克隆、重组及应用。
技术介绍
植物在生长发育过程中不断遭受各种生物及非生物的胁迫。如干旱、盐碱、寒冷、 高溫及病原菌的侵染等，与能移动的动物不同，植物在长期进化过程中发展起一套完善和 适合其自身需要的信号转导系统W适应环境变化，更好地生存。植物受到刺激后，会产生物 理或化学信号，运些信号到达祀细胞后转换成胞内信号，并启动细胞内各种信号转导系统， 继而对原初信号进行级联放大，使一些基因的表达受逆境调控，最终导致生理生化变化， 增强机体对逆境的胁迫抗性，其中促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases,ΜΑΡΚ)级联途径是信号从细胞表面传递到细胞核内部的重要途径。[000引ΜΑΡΚ级联途径包括Ξ种蛋白激酶：即ΜΑΡΚΚΚ、ΜΑΡΚΚ和ΜΑΡΚ。它们W逐级憐酸化 的方式构成信号放大途径，特异性的感受上游刺激，并将信号放大向下传递给祀蛋白。在植 物中，ΜΑΡΚ级联途径参与植物的生长发育及病原物侵染、机械伤害、触摸、低溫、高盐、渗透 胁迫W及活性氧胁迫等各种响应（Popescuetal.，2009)。 植物对干旱和高盐等逆境的抗性是受多基因控制的一个复杂的过程，而运些抗逆 基因的表达多是受逆境环境调控的，当植物感受到外界的生物、非生物胁迫信号时，机体的 逆境调控的抗逆相关基因才会表达，所W将外界的刺激信号有效地传递到细胞内，是提高 植物抗逆性的关键步骤。ΜΑΡΚ级联途径可将细胞外信号有效地传递到细胞内，在多层次上 调控抗逆基因的表达，如憐酸化水平、转录水平、转录后可变剪接等。因此利用ΜΡΚ级联途 径增强植物抗逆性成为改良植物抗逆性的重要途径。在抗逆基因工程领域，ΜΡΚ级联途径 一直备受关注，研究者们通过转基因手段将ΜΑΡΚ级联途径中的相关基因导入植物基因组 中，得到了许多抗性增强的转基因品种。MAP邸（mitogen-activatedproteinkinasekinase)基因是ΜΑΡΚ级联途径中 间的一个基因，人们从拟南芥、水稻、白杨等多种植物中发现了大量ΜΡΚ家族成员，研究发 现，在MAPKKKs、MAPKKs和MAPKsS种蛋白激酶中，MAPKKs的数量最少，接近MAPKs的二分之 一，且MAPKK所处ΜΑΡΚ级联途径的中间，在细胞信号传导过程中起着举足轻重的作用。根 据ΜΑΡΚ氨基酸序列中Ser/T虹保守亚结构域的特征和已掲示的功能，制订了一套分类命名 法。将植物MAP邸S分为A、B、C、D四组化ameletal.，2006)，其中拟南芥的MKKUMKK2 和MKK6都属于A类，MKK1 /MKK2-MPK4/MPK6级联在高盐、冷胁迫W及对病原菌的应急防疫 上起很大的作用。通过CLUSTALX比对发现，LmMAPKK属于A类，通过农杆菌介导的转基因 方法，在转基因烟草中验证其功能。发现该基因能够有效地提高植物的抗盐、抗低溫及病原 菌侵染的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种构杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPHO。 本专利技术的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。 本专利技术的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。 本专利技术的另一个目的在于提供该基因的用途。 本专利技术提供的一种构杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)，如序列表 中SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列构成。 本专利技术提供的一种构杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)编码的蛋白 质，如序列表中SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列的蛋白质。[001引本专利技术提供的一种构杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的重组克隆 载体pMD18-T-LmMAP邸。 含有上述的构杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的重组载体，运些 重组载体包括质粒。 所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体祀T28a-LmMAPKK。 所述的质粒表达载体双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK。 含有上述构杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的完整编码阅读框序 列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围。 所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或烟草细胞。 本专利技术提供了一种含有LmMAPKK基因的工程菌。 上述构杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK)的应用包括该基因编码的 蛋白在植物中的应用；用所述的重组载体，如植物表达载体转化玉米细胞；或者用所述含 有该基因的农杆菌与玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃馨、棉花、谷子、大麦W及花弁和 蔬菜等细胞共培养，得到转基因的再生植株；或者用所述的LmMAPKK遗传转化获得上述物 种转基因植株。 本专利技术的技术方案具体概述如下： 本专利技术的克隆方法由下述步骤组成： 从构杞新鲜叶片中提取总RNA，根据转录组化igene序列中构杞有丝 分裂原活化蛋白激酶激酶基因的核巧酸序列设计上游引物LmMAPKKF:5' ATGAAGAAAGGATCTTTTGCTCCTAATC-3'，然后利用3'RACE方法扩增得到完整的基因序列为 1074bp〇 本专利技术构建含有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因LmMAPKK的大肠杆菌表达载体 pET28a-LmMAP邸和植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAP邸，由下述步骤组成： 1)构建含有有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因的中间载体pMD18-T-LmMAPKK。 设计由沈QIDNO. 3所示的上游引物PUP1 :atgaagaaaggatcttttgctcctaatc)， 设计由沈QIDNO. 4 所示的下游引物P2(P2:taccgtcgttccactagtgattt)，W构杞cDNA为 模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于PMD18-T载体，获得含有序列表中SEQIDNO. 1 所示的LmMAPKK基因的中间载体pMD18-T-LmMAPKK。 2)构建大肠杆菌表达载体祀T28a-LmMAP邸 设计由沈QIDNO. 5 所不的上游引物P3 (P3:cgcggatccatgaagaaaggatcttttgctcct aatc)，设计由沈QIDNO. 6 所不的下游引物P4 (P4:acgcgtcgacaattatagctcattgagtgtt gcca)，WpMD18-T-LmMAPKK为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物用BamHI和Sail双酶 切，将祀T28a空载体用BamHI和Sail双酶切，分别纯化后进行连接，得到大肠杆菌表达载 体祀T28a-LmMAP邸。 3)构建植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK 设计由SEQIDNO. 5所示的上游引物P3,设计由SEQIDNO. 6所示的下游引物P4，WpMD18-T-LmMAPKK为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物用BamHI和Sail双酶切，将 PCAMBIA2300-35S-0CS空载体用BamHI和Sail双酶切，分别纯化后进行连接，得到植物表达 载体pCAMB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：季静，王罡，吴电云，金超，宋馨宇，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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