本发明专利技术公开了一种差分脉冲伏安法检测循环肿瘤细胞的传感器。该传感器的制备,包括以下步骤：按照现有方法制备出五氧化二钒纳米线，金银核壳纳米粒子；将五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体；将金纳米粒子修饰于电极表面，后连接硫醇化的适配体，特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体；将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测；利用电化学工作站检测。本发明专利技术的传感器特异性强，灵敏度高，操作简单，检测限低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞检测
，更具体的说是一种通过半导体催化产生还原电流，合金增强还原电流，从而检测循环肿瘤细胞个数，属于超灵敏的电化学细胞免疫传感器的制备技术。
技术介绍
近年来，免疫分析是临床检验中一项重要的肿瘤疾病的诊治手段。一直以来，恶性肿瘤也就是癌症是人类健康和生命安全的一个严重威胁。癌症细胞，是指一些拥有分裂潜能的细胞在致癌因素的作用下发生了恶性转化和克隆性增生而产生的一种新生物。并且癌细胞除了自身的生长失控外，还会侵入周遭正常组织甚至可以经由体内的循环系统或者淋巴系统转移到身体的其他部分，从而引起身体病变甚至死亡。所以，癌症早期的诊断和及早的治疗具有重要的意义。但是癌症早期的癌细胞含量较低很难被发现，低含量的癌症细胞的测定成为了分析人员的重要追求。免疫分析主要是基于用抗体(或抗原)作为选择性化学试剂以分析测定抗原(或抗体)及半抗原。它的提出及发展是生物分析化学最伟大的成就之一估计全世界每年要进行数亿次的免疫分析。免疫分析中发展快、应用广的首推放射免疫分析法(RIA)，RIA主要优点是，仪器自动化，操作简便，灵敏度高，样品制备简单；同时，由于临床样品中不存在放射活性物质，因而干扰少。然而，RIA需要进行放射性操作，仪器价格又贵，这便激发了科学家们努力探索非放射性标记的免疫分析方法，迅速发展起来了酶联免疫分析(ELISA)、发光免疫分析(LIA)、电化学免疫分析(ECIA)等方法。但是这些免疫分析方法一般耗时较长并且拥有繁琐的加样、温育、洗涤等操作过程，而且操作人员和免疫物质的接触较多，可能对操作的人员的身体健康造成危害。而且有些测定速度快、灵敏度高、检测性低的检测手段需要仪器昂贵，不能在发展中国家普及。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供了一种灵敏度高、检测速度快、试剂用量少，检测循环肿瘤细胞的电化学免疫传感器。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下措施来实现的:一种检测循环肿瘤细胞的电化学传感器的制备及应用方法，其包括以下步骤: (1)按照现有方法制备出五氧化二银纳米线，金银核壳纳米粒子； (2)将五氧化二银纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体； (3)将金纳米粒子修饰于电极表面，后连接硫醇化的适配体，特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二银纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体； (4)将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测。本专利技术所述五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体及电化学传感器的制备及应用包括以下步骤: (1)五氧化二钒纳米线的制备:其特征是将水溶性的硫酸氧钒与氧化剂溴酸钾在室温下混合，磁搅拌反应30 min，后通过硝酸降低酸度，将混合物水溶液在高压釜中以180 V反应24 h，取出高压釜冷却至室温，二次水多次冲洗得深黄色沉淀，将沉淀在80 °(:烘箱中烘干备用； (2)金纳米粒子储备液的制备:其特征是将1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL 二次水，置于100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软粉色，溶液经过离心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金纳米粒子储备液； (3)金银核壳纳米粒子的制备:其特征是将7mL (2)制备的金纳米粒子储备液与0.65mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合，磁搅拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β -环糊精和1.5mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁搅拌几分钟混勾。加入氢氧化钠溶液孵化10 min调整pH至10，将混合溶液85 ° C水浴。后连续磁搅拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸银溶液，滴加过程中，溶液逐渐由粉色变为亮黄色，得到金银核壳纳米粒子； (4)五氧化二f凡纳米线-金银核壳纳米粒子的制备:其特征是将(1)制备的五氧化二钥^纳米线取10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二稀二甲基胺溶液，超声30 min,离心水洗4次，后加入(3)制备的金银核壳纳米粒子0.5 mL，磁搅拌1 h，沉淀离心水洗多次至颜色不变，最后获得五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子； (5)制备五氧化二f凡纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体:其特征是先由0.1 Μ的氢氧化钠调整五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子的pH至9，后加入50 yL的5 μ Μ硫醇化适配体，混合溶液在4 ° C条件下磁搅拌12 h，后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，弃去上层清液，将沉淀溶解于含有1 mM Ca2+，1 mM Mn2+和0.1 %牛血清白蛋白的孵化缓冲液中，4 ° C下放置备用； (6)玻碳电极的修饰:其特征是将清洗好的玻碳电极插入2mL1 mM的氯金酸，在-0.2V电压下电沉积40 s，修饰上金纳米粒子，磷酸盐缓冲溶液冲洗，晾干备用； (7)将(6)修饰好的玻碳电极连接硫醇化的适配体，其特征是由6-巯基-1-己醇封装位点，接着捕获循环肿瘤细胞，连接五氧化二银纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体，电极插入包含25 μ Μ硫堇的0.01 Μ磷酸盐缓冲溶液中，通过差分脉冲伏安法检测还原电流得到结果。本专利技术中使用的洗涤溶液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液。本专利技术所述循环肿瘤细胞为乳腺癌细胞(MCF-7和T47D)。本专利技术的有益效果: (1)本专利技术利用差分脉冲伏安法进行测定，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性； (2)利用生物活性稳定、催化性质良好的五氧化二钒作为催化剂，并且五氧化二钒可以在双氧水存在的条件下催化染料小分子，产生还原电流； (3)金银核壳纳米粒子具有高导电性，同时放大了还原电流，起到放大信号作用。【附图说明】图1所示为本专利技术流程图。A所示为金纳米粒子；B所示为适配体；C所示为循环肿瘤细胞山所示为五氧化二钥i内米线；e所示为金银核壳纳米粒子。【具体实施方式】—种检测循环肿瘤细胞的电化学传感器的制备及应用方法，其包括以下步骤: (1)按照现有方法制备出五氧化二银纳米线，金银核壳纳米粒子； (2)将五氧化二银纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体； (3)将金纳米粒子修饰于电极表面，后连接硫醇化的适配体，特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二银纳米线-金银核壳纳米粒子修饰的适配体； (4)将制作好的电化学传感器结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测。本专利技术所述五氧化二钒纳米线-金银核壳纳米粒子结合修饰适配体及电化学传感器的制备及应用包括以下步骤: (1)五氧化二钒纳米线的制备:其特征是将水溶性的硫酸氧钒与氧化剂溴酸钾在室温下混合，磁搅拌反应30 min，后通过硝酸降低酸度，将混合物水溶液在高压釜中以180 V反应24 h，取出高压釜冷却至室温，二次水多次冲洗得深黄色沉淀，将沉淀在80 °(:烘箱中烘干备用； (2)金纳米粒子储备液的制备:其特征是将1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL 二次水，置于100 mL容量的三口圆底烧瓶中，在磁搅拌的情况下加热30 min，后加入2.5 mL1 %的柠檬酸钠，10 min内溶液先由黄色变为蓝灰色，最后变为软本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测循环肿瘤细胞的电化学传感器的制备方法，其包括以下步骤：首先，按照现有方法制备出五氧化二钒纳米线，金银核壳纳米粒子；然后，将五氧化二钒纳米线‑金银核壳纳米粒子结合修饰适配体，先由0.1 M的氢氧化钠调整五氧化二钒纳米线‑金银核壳纳米粒子的pH至9，后加入50 μL的5 μM硫醇化适配体，混合溶液在4 °C条件下磁搅拌12 h，后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，弃去上层清液，将沉淀溶解于含有1 mM Ca2+，1 mM Mn2+和0.1 %牛血清白蛋白的孵化缓冲液中，4 °C下放置备用；最后，将清洗好的玻碳电极插入2mL 1 mM的氯金酸，在‑0.2 V电压下电沉积40 s，修饰上金纳米粒子，磷酸盐缓冲溶液冲洗，晾干备用，后连接硫醇化的适配体，由6‑巯基‑1‑己醇封装位点，接着特异性结合循环肿瘤细胞，再连接五氧化二钒纳米线‑金银核壳纳米粒子修饰的适配体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：颜梅，邓文平，于京华，葛慎光，刘海云，张彦，申蕾，王秀，杨春蕾，朱少军，杨光鑫，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。