一种用于检测卡帕松制剂中醋酸格拉替雷浓度的色谱方法技术

一种用于检测卡帕松制剂中醋酸格拉替雷浓度的色谱方法。本发明专利技术涉及一种采用Thermo scientific Dionex液相色谱仪的Corona CAD电喷雾检测器，及专属于该型号检测设备的HPLC色谱条件，用于检测含有甘露醇辅料的醋酸格拉替雷样品(即市售卡帕松制剂)中的醋酸格拉替雷浓度。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测卡帕松制剂中醋酸格拉替雷浓度的色谱方法
本专利技术涉及一种用于检测醋酸格拉替雷样本的高效液相色谱(HPLC)方法及与其配套使用的内标肽组。
技术介绍
自身免疫类疾病(autoimmunediseases)是指，生物机体的免疫系统将一些机体本身的组织当作“外来物”进行攻击的现象。通常这种疾病可以通过阻碍生物机体T细胞和B细胞对机体自身组织的反应，得到缓解。这些早期的免疫反应是通过抗原结合到MHC分子上促进的，并通过T细胞表达出来。自身免疫类疾病就是机体本身的组织和蛋白质被当作“自抗原”，被机体免疫系统攻击。例如：多发性硬化症，就是免疫系统对隔离和保护神经的髓鞘进行攻击而导致的疾病，这种疾病发展到失去髓鞘，就会带来神经元和运动神经功能丧失；其他例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自免疫性溶血性贫血等，也属于此类疾病。很多药物开发出来用于治疗自身免疫类疾病，包括多发性硬化症。醋酸格拉替雷(又叫共聚物-1)是由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸通过聚合产生的不同分子量聚合物的混合物。它的四种氨基酸摩尔比大约是0.392～0.462:0.129～0.153:0.300～0.374:0.086～0.100(Ala：Glu：Lys：Tyr)，混合物中的共聚物的平均分子量大约5000～9000道尔顿。最早，Teitelbaum等在Eur.J.Immun.,1,242,1971中描述了合成共聚物-1的方法是由溶于1,4-二氧六环的L-丙氨酸的N-羧酸酐、L-酪氨酸的N-羧酸酐、γ-谷氨酸苄酯的N-羧酸酐和三氟乙酰基赖氨酸的N-羧酸酐制备保护的共聚物-1。然后用33％溴化氢的乙酸溶液除去谷氨酸残基上的γ-苄基保护基，同时部分的切断多肽的肽链，到三氟乙酰基共聚物-1。然后用哌啶水溶液除去赖氨酸残基上的三氟乙酰基保护基，得到粗共聚物-1。最后，经过透析，将溶液冻干，既得到共聚物-1原料药。由于共聚物-1是一种聚合混合物，其批与批之间的结构及氨基酸组成不可能完全一样，所以用普通的UV检测器是不能准备检测其含量的，因为批与批结构上的小差异及氨基酸组分的微小变化均会导致其响应信号的不同，所以其测定结果也会有较大误差。因此，为了准确测定其含量，首要问题就是提供一种与结构无关的质量型检测器。此外，在聚合物-1的研发过程中，在起始阶段由于没有合适的对照品，那么就需要采用TEVA的制剂作(Copaxone)为对照品使用，但其每支制剂里含有40mg的甘露醇，由于采用了质量型检测器，所以其原料与甘露醇的快速且集中的分离成为又一需要解决的难题。如果采用凝胶色谱柱或反相C18，由于本品是一种混合物，出峰不集中，就会导致信号重现性不好，所以就需要一种能将原料集中出峰且又能将甘露醇分离出来的色谱条件。
技术实现思路
为了解决上述在聚合物-1的研发和制备过程中所遇到的问题，专利技术人经过筛选，确定了采用ThermoscientificDionex液相色谱仪的CoronaCAD电喷雾检测器，并设计了专属于该型号检测设备的色谱条件。该检测器检测结果与分析物颗粒有关，信号电流与样品中分析物的质量成正比，因此无论何种化合物，只要进样质量相同响应都基本一致，所以CoronaUltra检测器能检测所有非挥发物，包括不含发色团的物质，不论被测物分子结构如何。本专利技术首先涉及一种检测含有甘露醇辅料的醋酸格拉替雷样品(市售卡帕松制剂)的浓度专用色谱检测方法，该方法使用ThermoscientificDionex液相色谱仪的CoronaCAD电喷雾检测器，色谱柱为：Kromasil60-5CN，4.6×250mm，5um；所述的色谱方法中，流动相的配制方法为，缓冲盐溶液与有机相按照缓冲盐溶液：有机相溶剂＝4：1～16(v/v)混合；所述流动相的pH值为2.0-5.0，优选为3.0；所述的有机相溶剂为乙腈或甲醇，优选为乙腈；所述的缓冲盐成分为甲酸铵、醋酸铵，优选为甲酸铵；所述缓冲盐溶液的浓度为0.1-0.5mol/l，优选为0.2mol/l。本专利技术所述的色谱检测方法中，色谱条件为，柱温20-60℃，优选为25℃。本专利技术所述的色谱检测方法中，样品的进样浓度为0.01-0.5mg/ml，优选为0.1mg/ml。本专利技术所述的色谱检测方法中，所使用的检测器是电喷雾检测器(CAD)或蒸发光散射检测器(ELSD)。附图说明图1、醋酸格拉替雷浓度的对数与检测器响应值的对数的线性回归曲线。图2、甘露醇浓度的对数与检测器响应值的对数的线性回归曲线。图3、卡帕松(Copaxone)制剂曲型的色谱图，前峰为醋酸格接替雷，后峰为甘露醇。图4、4a-4c，不同色谱条件下的卡帕松(Copaxone)制剂的色谱图。具体实施方式实施例1.色谱条件的筛选及验证色谱柱用Kromasil60-5CN,4.6×250mm，5um；流动相A为0.1M的甲酸铵(用甲酸调pH3.0),流动相B为乙腈，A:B＝50:50，进行等度洗脱；采用紫外检测器与电喷雾检测器串联，其中紫外在前电喷雾检测器在后。紫外检测器的检测波长为275nm，电喷雾检测器雾化气体采用高纯氮气，雾化温度为25℃；流速1.0ml/min，柱温：25℃，醋酸格拉替雷的色谱峰与甘露醇的色谱峰的分离度应大于4；醋酸格拉替雷拖尾因子应小于2.5。为了保证该分析方法的可行性，我们对该分析方法的线性及精密度进行了验证，结果如下：1.浓度线性关系分析：由于本分析方法所用的检测器为质量型检测器，其浓度与峰响应值之间的关系并不是直接的线性关系，是两者的对数值呈线性关系。因此，首先检测该色谱条件下，聚合物-1(醋酸格拉替雷)样品的浓度线性关系，结果见表1。进一步用上述数据中浓度的对数与进行线性回归，线性方程为y＝0.8054x+7.171，其相关系数的平方为0.9995，说明该方法中浓度的对数与检测器响应值的对数呈良好的线性关系。(图1)表1.醋酸格拉替雷线性考察称重(mg)面积浓度对数面积对数16.651424768011.2214142388.153744218.361550421811.2638726778.190449919.901645955321.2988530768.21641820.701702947111.3159703458.231201222.551827104241.3531465468.261763324.551948548471.3900514968.2897112接下来，检测该色谱条件下，甘露醇样品的浓度线性关系，结果见表2。进一步用上述数据中浓度的对数与进行线性回归，线性方程为y＝0.5649x+7.4936，其相关系数的平方为0.9996，说明该方法中甘露醇浓度的对数与检测器响应值的对数呈良好的线性关系。(图2)表2.甘露醇线性考察称重(mg)面积浓度对数面积对数33.992286883421.5313511658.35924436.352368045471.5605044158.3743942.152577924291.6247975798.411270243.632636342891.6397852138.421001946.882735571611.6709876038.437048148.022777329141.68142本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测卡帕松制剂样品中醋酸格拉替雷的浓度专用色谱检测方法，其特征在于，使用Thermo scientific Dionex液相色谱仪的Corona CAD电喷雾检测器，色谱柱为：Kromasil 60‑5CN，4.6×250mm，5um对样品中的醋酸格拉替雷浓度进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种检测卡帕松制剂样品中醋酸格拉替雷的浓度专用色谱检测方法，其特征在于，使用ThermoscientificDionex液相色谱仪的CoronaCAD电喷雾检测器，色谱柱为：Kromasil60-5CN，4.6×250mm，5um对样品中的醋酸格拉替雷浓度进行检测；检测样品时的流动相的配制方法为，缓冲盐溶液与有机相按照缓冲盐溶液与有机相溶剂的比例为4：1～16v/v混合；调节流动相的pH值为2.0-5.0；所述的有机相为乙腈或甲醇；所述的缓冲盐为甲酸铵、醋酸铵；所述缓冲盐溶液的浓度为0.1-0.5mol/l。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐洋明，李国弢，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44