一种用于检测醋酸格拉替雷样本的UPLC方法技术

本发明专利技术提供一组与醋酸格拉替雷(共聚物-1)结构相似的内标肽作为共聚物-1分子量测定用内标以及与其配套使用的UPLC检测及分离参数，使用方法能够在高分辨的UPLC分离技术下，更准确的测定目标聚合物的分子量及分子量分布。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测醋酸格拉替雷样本的超高效液相色谱色谱扣Itra PerformanceLiquidC虹omatography，IPLC)方法及与其配套使用的内标肤组。
技术介绍
自身免疫类疾病（autoimmunediseases)是指，生物机体的免疫系统将一些机体 本身的组织当作"外来物"进行攻击的现象。通常送种疾病可W通过阻碍生物机体T细胞和 B细胞对机体自身组织的反应，得到缓解。送些早期的免疫反应是通过抗原结合到MHC分子 上促进的，并通过T细胞表达出来。自身免疫类疾病就是机体本身的组织和蛋白质被当作 "自抗原"，被机体免疫系统攻击。例如；多发性硬化症，就是免疫系统对隔离和保护神经的 髓銷进行攻击而导致的疾病，送种疾病发展到失去髓銷，就会带来神经元和运动神经功能 丧失；其他例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自免疫性溶血性贫血等，也属于此类疾病。 很多药物开发出来用于治疗自身免疫类疾病，包括多发性硬化症。醋酸格拉替 雷（又叫共聚物-1)是由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸通过聚合产生的不同分子量聚 合物的混合物。它的四种氨基酸摩尔比大约是0.392~0.462:0. 129~0. 153:0. 300~ 0. 374:0. 086~0. 100(Ala;Glu;Lys;Tyr)，混合物中的共聚物的平均分子量大约5000~ 9000道尔顿。 为了能够确保得到的共聚物-1具有药效，就必须准确的知道多氨基酸混合物在 合成过程中的平均分子量分布和变化，例如用Superose。色谱柱进行分析确定分子量，但 是，由于对于不确定含量及分子量的聚合物混合物而言，由于没有标准对照物，因此，进行 分子量检测时，多使用内标法进行评价，此时，质量合乎标准的内标物质对于检测结果的准 确性至关重要。 对于共聚物-1的内标物，上世纪末，US6514938记载了使用合成的多肤作为内标 物调整色谱柱的校正系数，能够较为准确测量共聚物-1平均分子量。但是，随着分离技术 的不断发展，尤其是如高分辨的UPLC色谱OJltraPerformanceLiquidQiromatogra地y, 超高效液相色谱）技术的不断成熟，该方法专属性不强的缺点就被暴露出来，在如UPLC的 相对严格的条件下，需要对该方法进行修正，从而更准确的检测目标聚合物的分子量及分 子量分布，W便为相关的药物质量控制提供更为准确的参考。
技术实现思路
本专利技术提供一组与目标化合物（共聚物-1)结构相似的内标肤作为共聚物-1分 子量测定用内标W及与其配套使用的UPLC检测及分离参数，使用该内标能够在高分辨的 UPLC分离技术时，更准确的测定目标聚合物的分子量及分子量分布。为相关研究提供更为 真实的数据支持。 本专利技术首先涉及一种用来检测共聚物-1的UPLC方法，该方法使用BEH125SEC色 谱柱与邸肥OOSEC两根色谱柱任意串联的UPLC系统，柱参数为1. 7um，4. 6X150mm;使用抑 值3. 0-5.O(优选为3. 5)、浓度0. 1-0. 5mol/l(优选为0. 25)的甲酸倭或己酸倭作为缓冲 液；将所述缓冲液与己腊按照缓冲液；己腊=1:9配制流动相；所述流动相通过过滤法除菌 除杂。[000引本专利技术所述的UPLC方法中，绘制内标肤校准曲线和检测目标共聚物-1时的方法 参数还包括，本专利技术所述的串联色谱柱系统的进样和检测样本时，柱温控制在30-6(TC，优 选为5(TC;根据所述的串联系统，制备标准曲线时内标肤组的进样量为1-20U1，样品浓度 0.Ol~0.Img/ml，优选为0. 05mg/ml;根据所述的串联系统，检测目标共聚物-1时，样品的 浓度为 0. 1-lOmg/ml,优选为 4mg/ml。 本专利技术所述的UPLC方法中，所使用的内标肤组合共包含7条内标肤，所述的内标 肤序列见表1 表1.内标肤组合的序列结构及分子量 【附图说明】[001引图1、本专利技术所述的内标肤组不同条件下的色谱图：图la.使用本专利技术所述UPLC方法配合内标肤组进行UPLC色谱校正时的色谱图；图化.使用普通HPLC方法混合进样标 定本专利技术所述的内标肤组时的HPLC图谱；图Ic.使用普通HPLC方法分别进样标定本专利技术 所述的内标肤组时的HPLC拟合图谱。[001引图2、本专利技术所述的内标肤组的校正曲线：图2a.使用本专利技术所述UPLC方法配合 内标肤组进行UPLC色谱校正时的校正曲线；图2b.使用普通HPLC方法和本专利技术所述的内 标肤组校正时的校正曲线。 图3、聚合物-1的典型UPLC色谱图：图3a.使用本专利技术所述UPLC方法获得的典 型共聚物-I的色谱图；图3b.使用普通HPLC方法获得典型共聚物-I的色谱图。 图4、4a、4b、4c本专利技术所述的内标肤组的UPLC分离图谱【具体实施方式】 实施例1.内标肤组的合成及性质 分子量从5400-17000道尔顿的走条内标肤由本公司自行合成。送些内标肤编号 为TV-##，其中##为氨基酸残基数目（例如；TV-35就是含有35个氨基酸残基的肤链）。氨 基酸的组成与共聚物-1的特征值相符（表2)。 表2.内标肤组的各内标肤氨基酸组成 实施例2.W本专利技术UPLC-SEC超高压液相色谱方法，使用内标肤组校正色谱柱并 测量共聚物-1的分子量及分子量分布 用WatersAC卵口YUPLCB邸 125SEC色谱柱与WatersAC卵口YUPLC邸肥00沈C 两根色谱柱进行串联（注；两根色谱柱均为1.7um，4.6X150mm)，W〇.25mol/1的甲酸倭 (用甲酸调抑3. 5)与己腊按9 ;1的比例混合，过0. 2um滤膜后作为流动相，检测波长为 275皿，流速为0. 2ml/min，柱温；5(TC。对送走个内标肤的进行校正，内标组的每一个内标 肤的进样浓度为0. 〇5mg/ml，进样10U1，走个样本一起进样，获得的UPLC分离图谱见图la， 可见，采用该方法，能够很好的将内标肤进行分离。同时，送组内标肤与共聚物-1的保留时 间与其对应分子量的对数呈一定的相关性，对送走个内标肤的进行校正，其公式为；IogMw =A+BXRT，校正曲线采用的数据如下表3,由此得出的校正曲线见图2曰，对共聚物-1的典 型样本进行检测，色变图见图3曰。表3.使用本专利技术所述UPLC方法配合内标肤组绘制校正曲线时采用的数据随后，W同样的UPLC参数，对不同当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测醋酸格拉替雷(共聚物‑1)分子量和分子量分布的内标肽组，其特征在于，所述的内标肽组中共有7条内标肽，其氨基酸序列依次为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐洋明，李国弢，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44