本发明专利技术公开了一种用于诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.1，基因序列SEQ ID No.2，其保藏号为M2015388；同时公开了合成该重组蛋白的上下游引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4以及合成该重组蛋白的制备方法。通过west-blotern及ELISA检测发现该重组蛋白对羊脑多头蚴感染血清反应明显，表明这种重组蛋白对羊脑多头蚴病具有诊断价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种来源于多头带绦虫的重组蛋白及其制备方法，本专利技术还涉及该重 组蛋白在羊脑多头蝴病诊断上的应用。
技术介绍
脑多头蝴病（Coem/riAS1 cereAraJis)俗称脑包虫病，是多头带绦虫的幼虫，脑多头 蝴寄生于绵羊和山羊等有蹄类反刍动物脑内，可引起一种严重致死性的寄生虫病，人也可 作为中间宿主感染。其成虫寄生于犬科肉食兽的小肠。脑多头蝴病的致死率可达1〇〇%，给 畜牧业生产造成了巨大的经济损失。该病呈全球性分布，是一种重要的人畜共患寄生虫病。 所以该病的早期诊断对患畜的检疫与治疗有着非常重要的社会经济意义。 早期报道的羊脑多头蝴病诊断抗原有包囊液、原头节组织匀浆等粗抗原，但因其 抗原来源十分有限，而且其诊断的敏感性不高，特异性不强，与其他羊绦虫蝴病（如羊 细颈囊尾蝴病，羊囊尾蝴病）存在交叉反应。目前，一些重组抗原如Tm7等也被应用于诊 断，可能克服运用粗抗原作为诊断抗原的一些不足，当然，这些重组抗原对哪个感染时期的 血清或哪种感染剂量的血清敏感，还需进一步研究证实。
技术实现思路
本专利技术提供了一种诊断羊脑多头蝴病的重组蛋白。本专利技术同时提供了一种用于制 备上述重组蛋白的方法及制备该重组蛋白的引物，以及该重组蛋白的用途。 本专利技术提供的这种诊断羊脑多头蝴病的重组蛋白是脑多头带绦虫基因TmAdh3的 0RF序列在原核表达系统下的重组蛋白，其氨基酸序列是SEQ ID No. 1，基因序列为SEQ ID No. 2。该重组蛋白已于2 0 1 5年6月1 9日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保 藏编号为 CCTCC No :M2015388。 TmAdh3序列是以脑多头蝴原头苄基因组DNA为模板，分别以用上游引物序列SEQ ID No. 3和下游引物序列SEQ ID No. 4进行PCR扩增得到。 本专利技术的重组蛋白的制备方法是针对前述来源于多头带绦虫的TmAdh3基因全序 列，在其0RF序列5'端和3'端分别加上酶切位点及〃泌/ /及〇/后人工合成，测序获 得基因序列SEQ No. 3。接着将合成的SEQ No. 3产物与载体pGEX-4T-l分别用及碰^/ / 及〇/双酶切后回收产物以T4 DNA连接酶连接，转化DH5 a感受态细胞，获得重组表达质粒 pGEX-4T-TmAdh3,再转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个菌落接种于含有氨苄青 霉素（100 yg/mL)的LB液体培养基培养，将大量增菌诱导表达的菌体离心富集细菌培养 物沉淀，用PH7. 4 PBS缓冲液悬浮，反复冻融3次后超声裂解表达菌，分别收集裂解液的上 清及沉淀，用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式后，将可溶性表达上清用GST琼脂糖树脂 纯化，得到目标蛋白。 本专利技术提供的重组蛋白可在诊断羊脑多头蝴病中应用。通过west-blotern及 ELISA检测发现该重组蛋白对羊脑多头蝴感染血清反应明显，从而推测这种重组蛋白对羊 脑多头蝴病具有诊断价值。【附图说明】 图1是实施例一中TmAdh3基因的PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果。其 中，M: DNA分子质量标准DL2000 ; 1: TmAdh3基因PCR产物。 图2是实施例二中TmAdh3重组蛋白诱导表达及表达形式SDS-PAGE鉴定结果。 M :低蛋白分子质量标准；1 :pGEX-4T-l/BL21菌液未诱导；2 :pGEX-4T-l/BL21菌 液诱导；3 :pGEX4T-1-TmAdh3/BL21 菌液未诱导；4 :pGEX-4T-1-TmAdh3/BL21 菌液诱导；5 : pGEX4T-1-TmAdh3/BL21 裂解液的上清液；6-7 :pGEX-4T-1-TmAdh3 /BL21 裂解液2 mol/L尿 素洗涤液；8:?6￡乂41'-1-1'滅(1113/8121裂解液8 111〇1/1尿素溶解沉淀。 图3是实施例三中TmAdh3重组蛋白纯化产物SDS-PAGE鉴定。M:低蛋白分子质 量标准；1 :纯化后的重组TmAdh3蛋白。 图4是实施例四中TmAdh3重组蛋白与绵羊脑多头蝴感染血清进行Western blot 分析。M :蛋白质分子质量标准；1 :羊脑多头蝴自然感染血清；2 :健康羊血清。【具体实施方式】 本专利技术以下结合实施例作进一步详述。 一、脑多头蝴TmAdh3基因的克隆 1.基因组DNA的提取 从甘肃景泰屠宰场收集脑多头蝴病羊，开颅分离到脑多头蝴包囊，形态学检查确认后， 将原头节无菌条件下剥离后，用PBS洗涤，最后应用北京天根公司的组织DNA提取试剂盒提 取脑多头蝴基因组DNA，具体操作详见说明（略)。 2. TmAdh3基因的扩增 以前述内容1. 1提取的脑多头蝴基因组DNA为模板，用上游引物序列SEQ ID No.3 (5 ' -ATACGCAATGAITTGTGCCT-3 ')和下游引物序列 SEQ ID No.4 (5 '-ACGATGGCCTCGAAAGAITC -3< )进行 PCR 扩增得到。PCR 反应体系：10XPCR 缓冲液 5 ML， dNTP mixture (2.5 mmol/L)4 ML，引物（10 Mmol/L)各 1 ML，LA Taq DNA 聚合酶（5 U/ML) 0. 5 ML，模板基因组 DNA 1 ML，加入 ddH20 至 50 ML。反应条件：94°C 1 min;94°C 30 s， 50°C 30 s，72°C 2 min，35 个循环；72°C 5 min。反应结束后，取 5 ML PCR 产物于 8 g/L 琼脂糖凝胶中电泳观察结果。其余产物克隆于PMD18-T载体中，进行测序，获得TmAdh3基 因组DNA完整序列。 3. TmAdh3基因的克隆、序列分析 (1) 将上述2的PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化（北京天根公司DNA纯化试剂 盒），具体步骤见试剂盒说明（略）： (2) TmAdh3基因与pMD-18T克隆载体的连接 连接体系为：PMD18T克隆载体1 yL(50 ng/yL)，TmAdh3基因PCR纯化产物4 yL， Solution I 5 yL，混匀后置16°C连接4 h后转化AcWiDH5a感受态细胞，然后涂布于 氨苄青霉素抗性LB平板上，37°C培养过夜。挑选转化后的单个菌落，进行PCR阳性鉴定。 (3) TmAdh3基因的序列分析 分别取阳性重组菌送上海生工测序公司测序，分析测序结果，通过Blast分析确定其 0RF序列，去除信号肽序列并在5'端和3'端分别加上酶切位点及碰^/ /及〇/后人工 合成该序列。其基因编码的氨基酸序列为SEQ ID No. 2，基因编码的氨基酸序列为SEQ ID No. 1 〇 二、TmAdh3重组蛋白的表达 将上述人工合成的TmAdh3基因产物及pGEX-4T-l质粒，分别用及碰^/ /肋o I进 行双酶切，回收当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诊断羊脑多头蚴病的重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.1，基因序列SEQ ID No.2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李文卉，张念章，闫鸿斌，李立，岳龙，付宝权，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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