产丹皮酚的牡丹内生真菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产丹皮酚的牡丹内生真菌及其应用，属于植物内生真菌技术领域。本发明专利技术从牡丹植株中分离出了一株能够产丹皮酚的内生真菌G1-1，为镰刀菌属(Fusarium sp.)，保藏编号：CCTCC NO:M 2014662，保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。该菌株能够合成丹皮中主要的有效成分丹皮酚，通过大规模发酵培养镰刀菌属G1-1，即可在短时间内获得大量菌丝，从而获得丹皮酚，该方法可替代采挖植物药材获得丹皮酚，为生产丹皮酚提供新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种产丹皮酚的牡丹内生真菌，以及该内生真菌在产丹皮酚和制备生 防菌剂中的应用，属于植物内生真菌

技术介绍
植物内生真菌是指整个生活史或者生活史中的某一个阶段存在于植物组织内部 或者组织间隙，且不会引起宿主出现明显病症或者没有对宿主造成明显伤害的一类真菌。 国内外越来越多的研究表明，植物在与内生真菌相互作用的过程中，内生真菌能产生与植 物相同或相似的活性物质。内生真菌次生代谢产物的种类繁多，包括生物碱类、醌类、酸、甾 体类、萜类、肽类等，药理活性广泛，主要表现为抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、抗结核等。目 前，从药用植物中分离培养能产生活性物质的内生真菌已成为学者的研究趋势。 牡丹是我国特有的木本名贵花卉，在我国山东菏泽、安徽铜陵、重庆垫江、河南洛 阳等地均有大规模商品化种植。丹皮又称为牡丹皮，为牡丹的干燥根皮，其性微寒，味苦、 辛，归心、肝、肾经，具有清热凉血、活血化瘀的功效，为我国传统中药材。丹皮酚是牡丹丹皮 中主要的有效药用活性成分，凤丹皮作为丹皮中的道地药材，其丹皮酚含量最高。丹皮酚具 有解热、镇痛、抗真菌、抗病毒、抗癌等作用。从牡丹中分离出能产生丹皮酚的内生真菌，将 为丹皮酚的生产提供有益帮助。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产丹皮酚的牡丹内生真菌。同时，本专利技术还提供一种上述牡丹内生真菌在生产丹皮酚或制备生防菌剂中的应 用。 为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是： 产丹皮酸的牡丹内生真菌，为镰刀菌属（Fusariumsp. )G1_1，保藏编号：CCTCC N0:M2014662,保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学（湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中 心）。 产丹皮酚的牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014662)G1-1为镰刀菌属，镰刀菌属无性 时期原属于半知菌类，丛梗孢目，瘤座孢科。在PDA培养基上生长5d后，菌落呈现白色，呈 立体放射状生长，菌落直径达到7cm，几乎覆盖整个平板，菌丝生长高度达到0. 5cm，培养基 背面呈现红褐色，菌落质地疏松，继续培养到30d，菌落颜色一直呈现白色，培养基背面呈现 的红褐色继续加深。继续培养到45d后，观察显微结构，发现分生孢子梗短粗，分生孢子无 色，大型分生孢子两端尖，弯曲状，呈镰刀形。 产丹皮酚的牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014662)在生产丹皮酚中的应用。 产丹皮酚的牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014662)在制备生防菌剂中的应用。 本专利技术的有益效果： 本专利技术从牡丹植株中分尚出了一株能够产丹皮酸的内生真菌G1-1，在PDA培养基 上生长5d后，菌落呈现白色，呈立体放射状生长，菌落直径达到7cm，几乎覆盖整个平板，菌 丝生长高度达到〇. 5cm，培养基背面呈现红褐色，菌落质地疏松，继续培养到30d，菌落颜色 一直呈现白色，培养基背面呈现的红褐色继续加深。继续培养到45d后，观察显微结构，发 现分生孢子梗短粗，分生孢子无色，大型分生孢子两端尖，弯曲状，呈镰刀形。ITS序列分析 表明，内生真菌G1-1基因组扩增序列与序列编号FJ478128. 1的序列相似性高达99%，结合 形态学观察结果，鉴定该内生真菌G1-1为镰刀菌属（Fusariumsp.)，保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号：CCTCCN0:M2014662。 本专利技术中牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014662)能够合成丹皮中主要的有效成分 丹皮酚，通过大规模发酵培养镰刀菌属G1-1，即可在短时间内获得大量菌丝，从而获得丹皮 酚，该方法可替代采挖植物药材获得丹皮酚，为生产丹皮酚提供新的思路。 保藏证明和存活证明说明 保藏菌株：产丹皮酸的牡丹内生真菌，为镰刀菌属（Fusariumsp. )G1_1，保藏编 号：CCTCCN0:M2014662,保藏日期：2014年12月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中 心（CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学（湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中 心）。【附图说明】 图1为实施例1中供试品G1-1提取液的GC色谱图； 图2为对照品丹皮酚的GC色谱图； 图3为内生真菌G1-1的菌落形态图； 图4为内生真菌G1-1的孢子囊形态图； 图5为内生真菌G1-1基因组PCR扩增产物的电泳图； 图6为内生真菌G1-1的系统进化树； 图7为丹皮酚对照品的标准曲线。【具体实施方式】 下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。 实施例1 -、牡丹内生真菌的分离培养 牡丹内生真菌（CCTCCN0:M2014662)分离自健康的人工种植的洛阳凤丹的根、 茎、叶，凤丹采自洛阳牡丹园种植基地，植株年龄五年，植株健壮，无病虫害（详见"遗传资 源来源披露登记表"）。 具体的分离培养步骤如下：1)将五年生牡丹植株的根和茎切成1. 5cm左右的小段，叶切成2cm2左右的小片， 在超净工作台内对其表面消毒：根和茎分别用75%的酒精浸泡lmin，无菌水冲洗干净，再 浸泡于5 %次氯酸钠溶液4min，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗；叶用75 %的酒精浸泡 20s，无菌水冲洗干净，在无菌水中漂洗，再浸泡于5%次氯酸钠溶液45s，无菌水冲洗干净， 在无菌水中漂洗； 2)将消毒过的根和茎用无菌手术刀纵向剖开，叶剪成梳状，将根和茎的纵剖面平 铺在加有庆大霉素（4万U/L)的PDA培养基平皿上，叶平铺在平皿中，各重复5次，同时取 消毒过程中的前中后三个阶段的漂洗液滴在培养皿中做对照来验证表面消毒的状况； 3)将上述培养皿放入25°C恒温培养箱中培养，每天定时观察记录内生真菌的生 长状况，在培养基上观察到有菌丝生成时，及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝 或菌落移种到新鲜PDA培养基上，继续培养，待长出菌丝后继续分离纯化，直到分离到单一 菌株； 4)将单一菌株接种在PDA试管斜面培养基中，4°C保存备用。 PDA培养基制备方法如下：取新鲜马铃薯200g，切块，用蒸馏水煮沸30min，四层纱 布过滤取滤液，之后加入葡萄糖20g，琼脂17g充分溶解后再用蒸馏水补足到1000mL。将配 成的培养基在121°C下灭菌30min后，在超净工作台内分装至无菌培养皿中备用。 斜面PDA培养基为：取5mLPDA培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min，铺成斜 面冷却，以备保存菌种。 结果：从五年生洛阳凤丹的根，茎，叶中分离出内生真菌41株，并且对照组培养基 上并未长菌，证明所消毒程序彻底，分离到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。 二、牡丹内生真菌产丹皮酚能力的测定 将分离到的单一菌株进行扩大培养：分离到的每株内生真菌接种20个90mm的 PDA培养皿，倒置在25°C恒温培养箱中培养25天，待菌丝成熟后，用无菌手术刀片刮取菌 丝，将刮取的菌丝用无水甲醇进行研磨，研磨碎之后按照lg/20mL料液比用甲醇定容，在室 温下进行超声浸提30分钟，取浸提液加入2mL离心管中，以8000r/min的转速离心10分钟， 之后取上清液，用〇. 22ym的微孔滤膜进行过滤，取其滤液做成内生真菌提取物。同时，将 市售的丹皮酚标准品晶体本文档来自技高网...

【技术保护点】
产丹皮酚的牡丹内生真菌，其特征在于：其为镰刀菌属(Fusarium sp.)G1‑1，保藏编号：CCTCC NO:M 2014662。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国栋，董发明，李鹏，邱妍，白喜婷，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41