一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法技术

本发明专利技术公开了一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，采用走马胎种子无菌播种获得无菌植株，以无菌植株的茎段和芽进行愈伤组织诱导，通过愈伤组织分化成芽的途径可以快速获得大量芽，从而弥补一些植物组织培养阶段的丛生芽增殖系数低的缺陷。采用本发明专利技术方法可以在愈伤组织分化阶段快速增加走马胎的芽数，可在短时间内获得大量走马胎组培苗，从而降低培养成本，节约能耗。而且本方法操作简单，生产成本低，可工厂化生产走马胎的种苗，为走马胎可持续利用和保护生态环境多样性奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法
本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法。
技术介绍
走马胎（ArdisiagigantifoliaStapf）又名大叶紫金牛、走马风、豆收，为紫金牛科紫金牛属植物。全株药用，民间有“两脚行不开，不离走马胎”之说，具有活血化瘀、祛风湿、壮筋骨、止血生肌等功效，治疗风湿筋骨疼痛、跌打损伤、产后血瘀、痈疽溃疡等症。近年来，随着对走马胎化学成分和药理研究的不断深入，还含有显著的抗恶性肿瘤、抗血栓、抗炎、抗氧化等疗效的生物活性成分。走马胎的药用价值不断被挖掘，应用也越来越广，市场需求量不断增加。走马胎为常绿小灌木，根茎粗壮，主要分布在广西、广东、江西等地，多生于海拔1300m以下的山谷、溪旁的疏、密林下潮湿处。目前，走马胎药材主要来源于野生资源，需要生长三年以上，周期长，且产量不高。在走马胎野生分布区，药农长期的采而不种，造成野生自然资源过度采挖，使得走马胎分布点越来越少，资源日渐匮乏。随着走马胎供需矛盾日益尖锐，人工栽培势在必行。然而苗木供应紧张制约了走马胎的人工栽培。目前，走马胎的繁殖方式为扦插繁殖和种子繁殖，都难以提供大量种苗。主要由于以下两方面的原因：扦插繁殖存在母本数量少和繁殖系数低等问题；而种子繁殖则存在野生资源分散、成熟时间不一致造成种子采集困难等问题，且种子萌芽需要的时间长。植物组织培养具有不受时间和地点限制、繁殖系数高、可保持母本优良性状等特点，在植物种苗繁育上广泛应用。在走马胎组织培养研究过程中，由于走马胎为木本植物，取嫩芽为外植体时存在灭菌难等问题，而通过灭菌的种子在培养基上萌芽获得无菌植株，以其芽繁殖芽进行丛生芽诱导，存在增殖系数低、继代时间长等问题，造成培养成本高，严重阻碍了走马胎组培苗在人工栽培中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，而提供一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，通过走马胎愈伤组织诱导、分化成芽来提高走马胎出芽数量，该方法操作简单、稳定高效，并能大大降低组培苗的培养成本。实现本专利技术目的的技术方案是：一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，包括以下步骤：（1）在超净工作台上，将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌1min，无菌水清洗1次，再用0.1%升汞（HgCL2)溶液灭菌10min，无菌水清洗5次，放到灭菌过的滤纸上吸干水分，接入MS培养基上培养30～50d，种子萌芽，得到无菌植株；将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养35～45d，诱导率为100%；所述愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；(2)在超净工作台上，将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cm×0.2cm小块，接入增殖培养基中培养30d，增殖系数为3.7～6.2；所述增殖培养基为：MS+2,4-D0.5～2.0mg/L+6-BA0.1～0.5mg/L+TDZ0.5～2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；（3）在超净工作台上，取出步骤（2）中得到的愈伤组织切分成0.5cm×0.5cm小块，接入分化培养基中培养30d，分化率为100%，分化系数为4.2～13.7；所述分化培养基为：MS+ZT0.5～3.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+TDZ0.5～2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；（4）将步骤（3）中得到的芽切分成单芽，接入壮芽培养基中培养30～40d，芽长到2～5cm；所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；（5）将步骤（4）中得到的壮芽的基部切掉，接入生根培养基中培养45～55d，得到走马胎组培苗；所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8。所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是：培养温度为25±3℃,光照时间为12h/d，光照强度为2000Lx。所述培养基中，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，6-BA为苄氨基嘌呤，TDZ为噻重氮苯基脲，ZT为玉米素，IBA为吲哚-3-丁酸，NAA为a-萘乙酸，试剂均为分析纯，水为超纯水。所述培养基中附加TDZ对走马胎愈伤组织增殖和分化具有促进作用，在研究细胞分裂素（6-BA、KT、ZT）对走马胎愈伤组织分化影响试验中发现，ZT效果显著。所述增殖系数为增殖后的体积与增殖前的体积的比值。所述分化率是分化出芽的愈伤组织块数与总的愈伤组织块数比值；所述分化系数是愈伤组织分化出的芽数与愈伤组织块数的比值。本专利技术走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，采用走马胎种子无菌播种获得无菌植株，以无菌植株的茎段和芽进行愈伤组织诱导。愈伤组织为植物器官、组织脱分化的分生细胞经持续分裂增生成细胞团，是植物快繁的新手段。通过愈伤组织分化成芽的途径可以快速获得大量芽，从而弥补一些植物组织培养阶段的丛生芽增殖系数低的缺陷。本专利技术的优点：采用本专利技术方法可以在愈伤组织分化阶段快速增加走马胎的芽数，可在短时间内获得大量走马胎组培苗，从而降低培养成本，节约能耗。而且本方法操作简单，生产成本低，可工厂化生产走马胎的种苗，为走马胎可持续利用和保护生态环境多样性奠定基础。具体实施方式实施例1一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，包括以下步骤：（1）在超净工作台上，将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌1min，无菌水清洗1次，再用0.1%升汞（HgCL2)溶液灭菌10min，无菌水清洗5次，放到灭菌过的滤纸上吸干水分，接入MS培养基上培养40d，种子萌芽，得到无菌植株；将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养40d，诱导率为100%；所述愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；(2)在超净工作台上，将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cm×0.2cm小块，接入增殖培养基中培养30d，增殖系数为3.7,愈伤组织为青色致密组织；所述增殖培养基为：MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+TDZ0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；（3）在超净工作台上，取出步骤（2）中得到的愈伤组织切分成0.5cm×0.5cm小块，接入分化培养基中培养30d，分化率为100%，分化系数为4.2,芽较壮，叶色翠绿；所述分化培养基为：MS+ZT0.5mg/L+IBA0.1mg/L+TDZ0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；（4）将步骤（3）中得到的芽切分成单芽，接入壮芽培养基中培养30d，芽长到2～5cm；所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；（5）将步骤（4）中得到的壮芽的基部切掉，接入生根培养基中培养45d，得到走马胎组培苗；所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；所述愈伤组织诱导、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在超净工作台上，将走马胎种子经灭菌处理后接入MS培养基上培养30～50 d，种子萌芽，得到无菌植株；将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养35～45 d；所述愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4‑D0.5 mg/L+6‑BA0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为5.8； (2) 在超净工作台上，将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成小块，接入增殖培养基中培养30 d；所述增殖培养基为：MS+2,4‑D0.5～2.0 mg/L+6‑BA0.1～0.5 mg/L+TDZ0.5～2.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为5.8；（3）在超净工作台上，取出步骤（2）中得到的愈伤组织切分成小块，接入分化培养基中培养30 d；所述分化培养基为：MS+ZT0.5～3.0 mg/L+IBA0.1～0.5 mg/L + TDZ0.5～2.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为5.8；（4）将步骤（3）中得到的芽切分成单芽，接入壮芽培养基中培养30～40 d；所述壮芽培养基为MS+6‑BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为5.8；（5）将步骤（4）中得到的壮芽的基部切掉，接入生根培养基中培养45～55 d，得到走马胎组培苗；所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0 mg/L+6‑BA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为5.8。...

【技术特征摘要】
1.一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在超净工作台上，将走马胎种子经灭菌处理后接入MS培养基上培养30～50d，种子萌芽，得到无菌植株；将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养35～45d；所述愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；(2)在超净工作台上，将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成小块，接入增殖培养基中培养30d；所述增殖培养基为：MS+2,4-D0.5～2.0mg/L+6-BA0.1～0.5mg/L+TDZ0.5～2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；（3）在超净工作台上，取出步骤（2）中得到的愈伤组织切分成小块，接入分化培养基中培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：石云平，韦绍龙，李小泉，苏祖祥，林茜，张尚文，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45