突变受体以及它们在基于核受体的诱导型基因表达系统中的应用技术方案

本发明专利技术涉及生物技术或遗传工程领域。具体地，本发明专利技术涉及基因表达领域。更具体地，本发明专利技术涉及新型的置换突变型受体，和它们在基于核受体的诱导型基因表达系统中的应用，以及在宿主细胞中调节基因表达的方法，可用于各种应用，如基因疗法、大规模生产蛋白质和抗体、基于细胞的高通量筛选分析、功能基因组学和调控转基因生物的性状。

【技术实现步骤摘要】
突变受体以及它们在基于核受体的诱导型基因表达系统中的应用本申请是分案申请，原申请的申请日是2005年5月2日，申请号为200580018417.X(PCT/US2005/015089)，专利技术名称为“突变受体以及它们在基于核受体的诱导型基因表达系统中的应用”。本申请要求2004年4月30日提交的美国临时申请60/567,294和2004年9月13日提交的美国临时申请60/609,424的优先权。专利
本专利技术涉及生物技术或遗传工程领域。具体地，本专利技术涉及基因表达领域。更具体地，本专利技术涉及包含置换突变的新型核受体，和它们在基于核受体的诱导型基因表达系统中的应用，以及使用这种诱导型基因表达系统在宿主细胞内调节基因表达的方法。专利技术背景本文引用了各种公开物，它们的公开内容以其整体并入本文，作为参考。然而，本文中对任何文献的引用不应该解释为承认所引用的文献是相对于本申请的“现有技术”。在遗传工程领域，基因表达的精确控制对于研究、操纵和控制发育和其他生理过程而言是有价值的工具。基因表达是复杂的生物过程，涉及大量特定的蛋白质-蛋白质相互作用。引发基因表达，从而产生RNA，是蛋白合成所必需的第一步，为此，转录激活子必需被带到控制基因转录的启动子的附近。通常，转录激活子本身与具有至少一个DNA结合结构域的蛋白缔合，所述DNA结合结构域与存在于基因的启动子区域中的DNA结合位点结合。因此，为了使得基因表达发生，包含DNA结合结构域以及与该DNA结合域具有适当距离的反式激活结构域的蛋白必须被带入基因的启动子区域的正确位置。传统的转基因方法利用细胞型特异性的启动子来驱动设计的转基因的表达。含有该转基因的DNA构建物首先被整合入宿主基因组。当被转录激活子激发时，该转基因在给定的细胞类型中表达。在细胞中调控外来基因的表达的另一手段通过诱导型启动子进行。这样的诱导型启动子的应用例子包括PR1-a启动子、原核阻遏物-操纵子系统、免疫抑制-亲免素(immunophilin)系统和高等真核转录激活系统，例如蜕皮类固醇激素受体系统，下文对它们进行了描述。病原体攻击之后，来自烟草的PR1-a启动子在系统性获得性抗性应答期间得以诱导。因为PR1-a常常是对内源性物质和外部因素如病原体、UV-B辐射和污染物产生应答，所以PR1-a的应用可能受到限制。基于由热激、干扰素和重金属诱导的启动子的基因调控系统已被描述(Wurnetal.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5414-5418；Arnheiteretal.,1990,Cell62:51-61；Filmusetal.,1992,NucleicAcidsResearch20:27550-27560)。然而，由于这些系统对非目标基因的表达有影响，所以它们也有局限性。这些系统也是有遗漏性的。原核阻遏物-操纵子系统利用细菌阻遏蛋白和阻遏蛋白与之结合的独特操纵子DNA序列。大肠杆菌(Escherichiacoli)细菌的四环素(“Tet”)和乳糖(“Lac”)阻遏物-操纵子系统已经用于植物和动物来控制基因表达。在Tet系统中，四环素结合TetR阻遏蛋白，导致构象变化，从而将该阻遏蛋白从操纵子上释放下来，其结果是允许发生转录。在Lac系统中，在对存在的乳糖或合成的类似物如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的应答中，lac操纵子被激活。不幸的是，此类系统的应用受到配体即四环素和乳糖的不稳定的化学特性、它们的毒性、它们的天然存在性或者诱导或阻遏所需要的相对高的水平的限制。由于类似的原因，此类系统在动物中的应用受到限制。免疫抑制分子诸如FK506、雷帕霉素和环孢菌素A能够结合亲免素FKBP12、亲环素(cyclophilin)等。利用这些信息，已经设计出一般性的策略来使任何两个蛋白集合在一起，这仅仅是通过将FK506置于这两种蛋白的每一种上，或通过将FK506置于一个蛋白上而将环孢菌素A置于另一个蛋白上。合成的FK506同型二聚体(FK1012)或通过融合FK506-环孢菌素(FKCsA)而形成的化合物然后可以用于诱导这些分子的二聚体化(Spenceretal.,1993,Science262:1019-24；Belshawetal.,1996ProcNatlAcadSciUSA93:4604-7)。与FKBP12融合的Gal4DNA结合结构域和与亲环素融合的VP16激活子结构域，以及FKCsA化合物被用于显示异源二聚作用和在含有Gal4结合位点的启动子的控制之下对报告基因的激活作用。不幸的是，该系统包括可能具有不期望的副作用的免疫抑制剂，因此限制了其用于各种哺乳动物基因开关应用。高等真核生物转录激活系统例如类固醇激素受体系统也已得到应用。类固醇激素受体是核受体超家族的成员，发现于脊椎动物和无脊椎动物的细胞中。不幸的是，激活受体的类固醇化合物在调控基因表达中的应用特别是在植物和动物中的应用受到限制，原因是这些类固醇化合物在这些生物中参与许多其他的天然生物途径。为了克服这些困难，已经开发出了使用昆虫蜕皮素受体(EcR)的替代系统。昆虫的生长、蜕皮和发育受到蜕皮素类固醇激素(蜕皮激素)和保幼激素的调控(Dhadialla,etal.,1998,Annu.Rev.Entomol.43:545-569)。在昆虫中蜕皮激素的分子靶标至少由蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP,ultraspiracleprotein)组成。EcR是核类固醇受体超家族的成员，其特征为标志DNA(signatureDNA)和配体结合结构域以及激活结构域(Koelleetal.1991,Cell,67:59-77)。EcR受体对许多蜕皮类固醇化合物，例如松甾酮(ponasterone)A和幕黎甾酮(muristerone)A具有应答性。近来，已经描述了具有蜕皮类固醇激动剂活性的非固醇类化合物，包括商业上可获得的杀虫剂双苯酰肼和甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)，它们由RohmandHaasCompany在全球销售(参见国际专利申请PCT/EP96/00686和美国专利5,530,028)。两种类似物对其他生物都是非常安全的。昆虫蜕皮激素受体(EcR)与哺乳动物RXR的昆虫同源物超气门(USP)形成异源二聚体，结合蜕皮类固醇和蜕皮激素受体应答元件，并激活蜕皮激素应答基因的转录(Riddifordetal.,2000)。EcR/USP/配体复合物在昆虫发育和繁殖期间发挥重要作用。EcR是类固醇激素受体超家族的成员，具有五个模块结构域(modulardomain)，A/B(反式激活)、C(DNA结合，异源二聚体化)、D(铰链，异源二聚体化)、E(配体结合，异源二聚体化和反式激活)以及F(反式激活)结构域。这些结构域中的一些例如A/B、C和E当与其他蛋白融合时保留它们的功能。紧密调控的诱导型基因表达系统或基因开关(“geneswitchs”)可用于各种应用，如基因疗法、在细胞中大规模生产蛋白、基于细胞的高通量筛选分析、功能基因组学和调控转基因植物和动物的性状。第一种基于EcR的基因开关使用黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)EcR(DmEcR)和小家鼠(Musmusculus)RX本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因表达调节系统，包括基因表达盒，所述基因表达盒能够在宿主细胞中被表达，所述基因表达盒包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：i)反式激活结构域；ii)识别应答元件的DNA结合结构域，所述应答元件与其表达待被调节的基因连接；和iii)H组核受体配体结合结构域，其包括至少一个突变，所述突变的位置在等同于或类似于选自下述的氨基酸残基处：a)SEQ ID NO:1的48、51、52、54、92、95、96、109、110、119、120、125、128、132、219、223、234和238中的至少一个；b)SEQ ID NO:1的96和119；c)SEQ ID NO:1的110和128；d)SEQ ID NO:1的52和110；e)SEQ ID NO:1的107、110和127；f)SEQ ID NO:1的52、107和127；和g)SEQ ID NO:1的107、127和259，或它们的任何组合。

【技术特征摘要】
2004.04.30 US 60/567,294;2004.09.13 US 60/609,424;1.基因表达调节系统，包括基因表达盒，所述基因表达盒能够在宿主细胞中被表达，所述基因表达盒包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：i)识别应答元件的DNA结合结构域，所述应答元件与其表达待被调节的基因连接；和ii)如SEQIDNO:1中所示的蜕皮激素受体配体结合结构域，其中在SEQIDNO:1的48位置处发生以下置换突变之一：F48Y、F48W、F48L或F48R的突变。2.根据权利要求1所述的基因表达调节系统，进一步包括第二个核受体配体结合结构域，其选自脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、超气门蛋白配体结合结构域，和包含两个多肽片段的嵌合配体结合结构域，其中第一多肽片段来自脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域或超气门蛋白配体结合结构域，并且第二多肽片段来自不同的脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域、无脊椎动物类视黄醇X受体配体结合结构域或超气门蛋白配体结合结构域。3.基因表达调节系统，包括：a)第一基因表达盒，其能够在宿主细胞中被表达，包含编码第一多肽的多核苷酸，所述第一多肽包括：i)识别应答元件的DNA结合结构域，所述应答元件与其表达待被调节的基因连接；和ii)核受体配体结合结构域；以及b)第二基因表达盒，其能够在宿主细胞中被表达，包括编码第二多肽的多核苷酸，所述第二多肽包括：i)反式激活结构域；和ii)核受体配体结合结构域，其中，所述核受体配体结合结构域中的一个是如SEQIDNO:1所示的蜕皮激素受体配体结合结构域，其中在SEQIDNO:1的48位置处发生以下置换突变之一：F48Y、F48W、F48L或F48R的突变。4.根据权利要求1或权利要求3所述的基因表达调节系统，其中所述DNA结合结构域选自蜕皮激素受体DNA结合结构域、GAL4DNA结合结构域和LexADNA结合结构域。5.根据权利要求3所述的基因表达调节系统，其中所述反式激活结构域选自蜕皮激素受体反式激活结构域、VP16反式激活结构域、B42酸性激活物反式激活结构域和p65反式激活结构域。6.分离的多核苷酸，其编码如SEQIDNO:1所示的蜕皮激素受体配体结合结构域，其中在SEQIDNO:1的48位置处发生以下置换突变之一：F48Y、F48W、F48L或F48R的突变。7.表达载体，包含可操作性地连接到转录调控元件的权利要求6所述的分离的多核苷酸。8.分离的宿主细胞，包含权利要求7所述的表达载体，其中所述转录调控元件在所述宿主细胞中是可操作性的。9.分离的多肽，由根据权利要求6所述的分离的多核苷酸编码。10.分离的多肽，包含如SEQIDNO:1所示的蜕皮激素受体配体结合结构域，其中在SEQIDNO:1的48位置处发生以下置换突变之一：F48Y、F48W、F48L、或F48R的突变。11.在分离的宿主细胞中调节基因表达的方法，包括下述步骤：a)将根据权利要求1或权利要求3所述的基因表达调节系统导入所述分离的宿主细胞；和b)将二酰肼或四氢喹啉配体导入所述分离的宿主细胞；其中待被调节的基因是基因表达盒的组成部分，所述基因表达盒包括i)被DNA结合结构域识别的应答元件；ii)被反式激活结构域激活的启动子；和iii)其表达待被调节的基因；由此，一旦所述配体被导入所述分离的宿主细胞，b)iii)的所述基因的表达被调节。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述配体选自：a)下式化合物：其中：E是含有叔碳的支链(C4-C12)烷基或支链(C4-C12)烯基，或含有叔碳的氰基(C3-C12)烷基；R1是H、Me、Et、i-Pr、F、甲酰基、CF3、CHF2、CHCl2、CH2F、CH2Cl、CH2OH、CH2OMe、CH2CN、CN、1-丙炔基、2-丙炔基、乙烯基、OH、OMe、OEt、环丙基、CF2CF3、CH＝CHCN、烯丙基、叠氮、...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·R·帕里，M·B·库玛，
申请(专利权)人：因特莱克森公司，
类型：发明
国别省市：美国;US