一种简易快速筛选抗真菌药物的方法技术

本发明专利技术公开了一种简易、快速筛选抗真菌药物的方法，包括培养基的配制、水霉株的分离、提纯培养、药浴施药等步骤，只要计算出试验组与对照组菌落R1/RO比值，即可通过查对“菌落R1/RO比值－抑霉率对应表格/曲线”快速知晓该药物浓度下的抑霉率。本发明专利技术具有简单、易行、快速、直观等特点；适用于科研院所、学校、技术推广站及水产养殖公司。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产养殖病害防控
，具体涉及水生动物水霉病药物筛选的方 法。本专利技术简单、易行，适合科研院所、学校、技术推广站及水产养殖公司应用。 技术背景 水霉病是水生动物（如：鱼、虾、蟹、龟、蛙等）体表的一种水霉寄生病，水霉对寄 主无严格选择性，各种水生动物，从卵到各龄成体都可感染。当水生动物体表皮肤因物理 化学因素，或细菌、病毒感染受损伤时，水霉的游动孢子侵入伤口，吸取皮肤及其组织内 的营养而迅速生长，菌丝与伤口的组织细胞缠绕粘附，使组织发炎、坏死，水生动物因负 担过重，游动失常，食欲减退，很快瘦弱死亡。水霉在寄主死后不久繁殖特别快，所以具 腐生性，对水产动物是一种继发性感染。长期以来，水霉病的防治是水生动物病害防治中 最棘手的一个难题之一，水霉病的频发给全球水产养殖业带来巨大的经济损失。为了更好 地开展对水霉病的防治工作，国内外许多科学家都致力于水霉属（Saprolegnia)的研究。 由于存在巨大的市场需求，渔药市场上防治水霉药物可谓是"五花八门"，质量良 莠不齐，有的渔药厂家甚至盲目夸大宣传误导消费者。目前，水产养殖单位或个人还无法辨 别药物的质量，在药物时也多由渔药经销商推荐或根据药品说明进行购买，这势必会因药 物防治效果不佳，而殆误治病时机，水产养殖者带来巨大的经济损失。为了降低水霉对水生 动物危害，加快抗真菌（水霉）药物筛选和评定商品药物的防治效果将已成为相关部门的 当务之急。 本专利技术本着廉价、易得、操作简易、直观快速的原则设计出一种简易、快速筛选抗 真菌药物的方法。该专利技术因简单、易行、快速等特点，非常适合科研院所、技术推广部门和基 层水产养殖单位应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简易、快速筛选抗真菌药物的方法。 本专利技术的目的通过以下技术方案实现： -种简易快速筛选抗真菌药物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)从水生动物体表取少量含水霉菌丝的组织或带有水霉菌的卵在75%的酒精 中浸泡2-3min,用无菌水冲洗数次后置于PDA链霉素平板中央，平板倒置在20-25°C条件下 培养； (2)切取步骤（1)平板中菌落边缘的菌丝块，在75%的酒精中浸泡2-5sec，用无 菌水冲选后将菌丝面朝下反接种到新的PDA半固体平板的中央，均匀在平板空白处放入水 霉菌诱饵；扣上皿盖后将平板倒置放入20-25Γ恒温培养恒温继续培养，待诱饵上覆盖菌 丝后将其取出并置于无菌水的6孔板中，于20-25Γ培养直至游动孢子释放；吸取100 μ L 孢子悬液至PDA半固体平板上均匀涂布，20-25°C恒温培养并切取单菌落琼脂块到PDA半固 体平板上进行纯化培养；提纯后的水霉菌株可置于4°C保存； (3)将试验药物用蒸馏水配10-20000ppm (mg/1)的母液；在多孔板中按倍比 法稀释成梯度浓度，以蒸馏水为对照，每个浓度中加入1-2块步骤（2)的水霉菌丝块 2*2-5*5mm 2,于2〇-25°C条件恒温培养，24h-48h后取出观察，确定每种药物的最高无效浓 度与最低有效浓度； (4)试验药物的最高无效浓度与最低有效浓度确定后，取最高无效浓度与最低有 效浓度之间的三个浓度值，配制相应浓度药液；取2*2-5*5mm 2水霉菌丝块，将菌丝面朝下反 接种到PDA半固体平板的中央，然后从平皿边缘慢慢倾入10-15ml药液，于22°C条件下培 养24h，然后通过测量尺测量对照组的水霉菌落半径R。和试验组水霉菌落半径R i，计算抑 霉率，计算公式：抑霉率（％)= 100*; (5)以VR。为横坐标，抑霉率为纵坐标，绘制R 7R。比值一抑霉率工作曲线；根据 工作曲线，快速查询不同药物浓度对应的抑霉率。 步骤⑴中所述PDA链霉素平板的制备方法为：①配制PDA半固体培养基，配方如 下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条6g或琼脂粉4g，自来水1000 ml ;②将PDA半固体培养 基溶化后，冷却至40-60°C，注入200mg/l的链霉素，制成平板。 本专利技术通过筛选抗真菌药物过程中液体与半固体培养基的的配制、水霉株的培 养，测量与计算经过培养后试验组与对照组菌落 Rl/R。比值，即可通过查对"菌落R/R。比 值一抑霉率对应表格/曲线"快速知道该药物浓度下的抑霉率。具体方法为： UPDA半固体培养基的制作： A、配方： 马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000ml，琼脂条6g (或琼脂粉4g)自然pH。 B、制法： 马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可），用4 层纱布过滤，再加入糖与琼脂，加热融化后补足水到1000ml，分装于三角瓶中，用纱布+牛 皮纸（报纸）+棉线扎封口。然后在于121°C条件下灭菌20min。 *注意事项： ⑴、三角瓶中的装液量以不超过总容量的1/2~3/5为宜，以防止灭菌时培养基在 沸腾中沾污纱布及存放中易导致瓶内培养基染菌等。 ⑵、用高压灭菌锅时要注意排冷空气，防止"假升镑"现象。 ⑶、培养皿在清洗后，用纸包好可在高压灭菌锅中于121°C条件下灭菌15-20min， 待自然降压为" 〇 "后，取出置于干燥箱中烘干，等降温后置于超净工作台中备用。（也采取 干法灭菌：将培养皿在清洗后，用纸包好置于160°C的烘箱中灭菌2h后备用） C、倒平板： 灭过菌后的培养基与培养皿放在超净工作台中，先用紫外线灭菌15min后关掉紫 外灯，后打开风机使超净工作台中呈正压状态；操作员的双手洗净后，用酒精棉球擦拭后伸 入操作台中，等培养基降温到60°C后在酒精灯旁将培养基倒入培养皿中，每皿中倒入15ml 左右（注意：据有关资料报道琼脂在43°C以下会凝固，故倒平板时培养基的温度高一些，可 提高培养基的流动性），倒平板后放置到第二天使用（等培养基中的冷凝水干后使用一为 加快速度可用"叠皿法"倒平板且倒后平板后加大超净工作台中的风量）。 *相关的微生物操作方法：可参考周德庆《微生物学实验教程》第2版 2、水霉株的分离、提纯培养： 分离： 从水生动物体表取少量含水霉菌丝的组织或将带有水霉菌的卵先在75%的酒精 中浸泡2-3min，用无菌水冲洗数次后置于PDA链霉素平板（将PDA半固体培养基溶化后， 冷却至40-60°C，注入200mg/L的链霉素，制成平板），中央，平板倒置在20-25°C条件下培 养。 提纯： 在酒精灯下用灼烧冷却后的解剖刀切取分离平板中菌落边缘的菌丝块 (2*2-5*5mm 2)在75%的酒精中浸泡2-5seC，迅速用无菌水冲选后反接种（将菌丝面朝下） 到新的PDA半固体平板的中央，再均匀在培养皿中空白处放入5-20粒无菌油菜籽（水霉菌 诱饵）；扣上皿盖后将平板倒置（皿底在上，皿盖在下防止培养基水分蒸发）放入20-25Γ 恒温培养恒温继续培养，待油菜籽上覆盖菌丝后将其取出并置于无菌水的6孔板中，于 20-25°C培养直至游动孢子释放。无菌吸取100 μ 1孢子悬液至PDA半固体平板上均匀涂 布，20-25Γ恒温培养并切取单菌落琼脂块到PDA半固体平板上进行纯化培养。提纯后的水 霉菌株可置于4°C保存。 3、快速药物筛选程序： ⑴、试验药物浓度范围（最高无效浓度与最低有效浓度）的快速确定 将试验药物根据中、西药的不同，用蒸馏水浓度配1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简易快速筛选抗真菌药物的方法,其特征在于，包括以下步骤：(1)从水生动物体表取少量含水霉菌丝的组织或带有水霉菌的卵在75％的酒精中浸泡2‑3min,用无菌水冲洗数次后置于PDA链霉素半固体平板中央，平板倒置，在20‑25℃条件下培养；(2)切取步骤(1)平板中菌落边缘的菌丝块，在75％的酒精中浸泡2‑5sec,用无菌水冲选后将菌丝面朝下反接种到新的PDA半固体平板的中央，均匀在平板空白处放入水霉菌诱饵；半固体将平板倒置放入20‑25℃恒温培养恒温继续培养,待诱饵上覆盖菌丝后将其取出并置于无菌水的6孔板中,于20‑25℃培养直至游动孢子释放；吸取100μL孢子悬液至PDA半固体平板上均匀涂布,20‑25℃恒温培养并切取单菌落琼脂块到PDA半固体平板上进行纯化培养；提纯后的水霉菌株可置于4℃保存；(3)将试验药物用蒸馏水配10‑20000ppm(mg/l)的母液；在多孔板中按倍比法稀释成梯度浓度，以蒸馏水为对照，每个浓度中加入1‑2块步骤(2)的水霉菌丝块2*2‑5*5mm2，于20‑25℃条件恒温培养，24h‑48h后取出观察,确定每种药物的最高无效浓度与最低有效浓度；(4)试验药物的最高无效浓度与最低有效浓度确定后，取最高无效浓度与最低有效浓度之间的三个浓度值，配制相应浓度药液；取2*2‑5*5mm2水霉菌丝块，将菌丝面朝下反接种到PDA半固体平板的中央，然后从平皿边缘慢慢倾入10‑15ml药液，于22℃条件下培养24h,然后通过测量尺测量对照组的水霉菌落半径R0和试验组水霉菌落半径R1，计算抑霉率，计算公式：抑霉率(％)＝100*[1－(R1/R0)2]；(5)以R1/R0为横坐标，抑霉率为纵坐标，绘制R1/RO比值－抑霉率工作曲线；根据工作曲线，快速查询不同药物浓度对应的抑霉率。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周呈祥，叶伟武，同现鹏，张繁荣，夏文伟，仲崇艳，凌武海，
申请(专利权)人：杭州银江环保科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33