一种纤维材料的细胞毒性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种纤维材料的细胞毒性检测方法，所述检测方法包括：将统一长度的纤维整齐排列制成片状单体，所得片状单体采用浸提法或直接接触法，进行MTT细胞毒性检测。本发明专利技术将纤维制备成片状样品，再进行MTT细胞毒性检测，具有操作简单、重现性好和判定方便等特点，解决了长丝状纤维由于长径比大、比表面积高而不能很好的进行纤维类医疗器械材料及制品的安全性技术评价的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纤维类医疗器械材料及制品的安全性技术评价领域，具体设及一种纤 维材料的细胞毒性检测方法。
技术介绍
医用纤维特别是可降解医用纤维的研究和应用已成为植入医疗器械研发的热点， 对其细胞毒性的评价是临床前研究的重要内容。生物医用材料及相关医疗器械的细胞毒性 测试和评价方法主要有ISO10993. 5-2009(医疗器械的生物学评价第5部分；体外细胞毒 性试）和中国国家标准GB/T16886. 5-2003,该方法适用于医疗器械的体外细胞毒性实验。 上述两个标准基本上等同，主要用于医疗器械的细胞毒性评价。 由于医疗器械设及的范围太广、材料种类繁多，现有测试方法中的规定比较笼统， 在实际应用中的可操作性不理想。上述标准应用于医用纤维的细胞毒性测试时，在样品制 备、细胞毒性的定量测试方面就存在不足。 标准中的浸提法在样品制备方法上存在不足，对于医用纤维长丝来说，由于其长 径比大、表面积不是平面，纤维直径不同，比表面积差异很大；如果按照不规则形状固体器 械执行，如0. 2g/血的浸提比例，那么溶液无法完全浸泡纤维。 匀浆法在样品制备方法上也存在不足，原因在于；在冰浴上，用匀浆仪将材料制备 成不同浓度的混悬液，对材料进行细胞毒性，采用该方法制样时，由于制备医用纤维的材料 来源广泛，包括合成材料(聚哲基己酸醋、聚乳酸、聚己内醋等）和天然材料(海藻酸钢纤维、 壳聚糖纤维）制备的纤维，W及非降解性纤维(主要指聚己締纤维、巧龙纤维等)，各种材料 由于强度和初性差异较大，导致材料的力学性能差异很大。在制浆过程中，初性好的材料不 容易破碎，而初性差的材料容易破碎。 直接接触法适用于存在一定的平面和规则几何外形的样品，纤维材料在实验过程 中操作难度较大；在我们前期的研究中发现，纤维材料采用直接接触法进行细胞毒性实验 时，最简便的方法是将长丝缠结成团塞入孔板。然而，缠团的长丝在实验过程中容易散开， 松紧程度不好控制，测试结果不理想。
技术实现思路
针对现有检测技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种纤维材料的细胞毒性检测 方法。 本专利技术所采取的技术方案是； ，其特征在于；将统一长度的纤维整齐排列制成片 状单体，所得片状单体采用浸提法或直接接触法，进行MTT细胞毒性检测。 优选的，采用超声波焊接将统一长度的纤维整齐排列制成片状单体。 优选的，将统一长度的纤维整齐排列制成片状单体的方法，包括W下步骤： 1)裁取统一长度的纤维，将纤维在聚四氣己締薄膜上整齐排列成近似平行状态； 2) 在排列整齐的纤维上面覆盖一层聚四氣己締薄膜，放入超声波焊接机中； 3) 采用点柱型或网格型的焊接模具进行焊接，得片状单体。 优选的，所述检测方法，包括W下步骤： 将统一长度的纤维整齐排列制成片状单体，将所得片状单体浸提后得到的浸提液或片 状单体本身，加入到采用常规细胞培养液培养的细胞中，解育，解育结束后，MIT染色检测细 胞存活率。 优选的，所述细胞处于对数生长期。 优选的，所得片状单体在无血清的细胞培养液中浸提。优选的，浸提条件；无菌条 件下，于37 + 1 °C，浸提24 + 2h。 优选的，所述片状单体直接加入到采用常规细胞培养液培养的细胞前，先在常规 细胞培养液浸透。优选的，浸透时间为15~30min。对于容易吸水的片状单体，为防止样 品对常规细胞培养液的吸附，采取提前在常规细胞培养液中浸透。 优选的，所述纤维为纤维长丝。优选的，所述纤维为医用纤维长丝。 优选的，纤维包括聚乳酸纤维、聚己内醋纤维、聚哲基己酸醋纤维、聚酷胺纤维、上 述纤维的原材料任意复合所得纤维。 本专利技术采用直接接触法进行MTT细胞毒性检测时，将片状单体采用紫外光灭菌， 在超净工作台内用无菌剪刀裁剪，使样品的覆盖面积应大于MTT细胞毒性检测所用孔板面 积的四分之一、小于四分之S。 本专利技术采用浸提法进行MTT细胞毒性检测时，可W测定样品中的加工助剂、加工 过程中产生的低分子组分和残留溶剂的毒理学危害，浸提条件模拟或严于临床使用条件， 但不应导致试验材料发生诸如烙化、溶解或化学结构改变等明显变化。 将经灭菌处理的片状单体按表1的纤维直径选择浸提比例。 表1纤维直径与浸提液比例选择_本专利技术将纤维制备成片状样品，再进行MTT细胞毒性检测，具有操作简单、重现性好和 判定方便等特点，解决了长丝状纤维由于长径比大、比表面积高而不能很好的进行纤维类 医疗器械材料及制品的安全性技术评价的问题。 本专利技术针对长径比大、比表面积高的医用纤维材料，通过改进制样方法和细胞毒 性测试指标，建立了一种快速、重现性好的MIT检测法。 本专利技术的有益效果是： 本专利技术采用超声波焊接将纤维焊接制备成片状样品，具有制样过程无污染和样品状态 基本保持不变的优点，细胞毒性测试采用MTT细胞毒性检测，也就是MIT染色后测定光密 度，具有操作简单、重现性好和判定方便等特点，克服了现有技术无法解决长丝状样品制备 和直接接触法测试差异较大的不足。【具体实施方式】 -种纤维材料的细胞毒性检测方法，包括W下步骤： 1) 取长度为10cm左右的聚乳酸（PLA)纤维长丝20~30g，将其在聚四氣己締薄膜上均匀 排列成近似平行状态，上面再覆盖一层聚四氣己締薄膜，将所得材料放入超声波焊接机中， 采用点柱型或网格型的焊接模具进行焊接，压力1.OMPa、焊接时间1. 5s、冷却时间2.Os，制 得薄片状的医用纤维膜； 2) 将医用纤维膜采用紫外光灭菌，在超净工作台内用无菌剪刀剪成3mmX3mm的矩 形样品，样品的覆盖面积应大于孔板面积的四分之一、小于四分之S为宜，对于容易吸水的 样品，为防止样品对培养液的吸附，在37±rC下浸透15-30min;或者将经灭菌处理的医 用纤维膜按表1的纤维直径选择浸提比例： 医用纤维膜采用无血清的培养液，DMEM;浸提条件；无菌条件下，于37 + 1 °C，浸泡 24 + 2h，去除医用纤维膜，得浸提液； 3) 通过酶消化法（0. 25%的膜蛋白酶）将L929细胞从培养瓶中转移出来，离屯、细胞悬 液（200g，3min),然后将细胞重悬于培养液中调整细胞浓度为5X104个/111以接种密度 为5, 000个/孔（100y1培养液），于96孔培养板内，轻轻转动培养板，使细胞均匀地 分散在器皿的表面。（最外一圈的孔只加培养液，不作为测定孔用)，每个样品组做5个平行 孔，其中左侧和右侧均放置空白对照孔(不加任何样品的细胞培养液)，W判断细胞接种的 误差。在37±rC、5%C〇2条件下培养至半汇合单细胞层，通过在相处显微镜下观察，确认 细胞接种误差，及细胞的生长状态； 4) 将培养液去除，加入各组样品，所述样品为3mmX3mm的矩形样品或浸提液100 y以其中直接接触样品(矩形样品）组需更换100yL培养基后，轻轻地将样品放置在细胞 层表面，确保样品至少覆盖细胞层全部表面的四分之一。加样完毕后，轻轻转动96孔培养 板，使样品均匀分布在细胞层表面。解育4她后，至细胞为近汇合； 5) 将直接接触样品用无菌綴子取出(浸提液样品不需处理)。在相差显微镜下观察细胞 的生长状态。加入10化的CellCountingKit-8试剂（Dojindo公司，注意不要在孔中生 成气泡)，轻轻敲击培养板W混匀，继续解育2h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维材料的细胞毒性检测方法，其特征在于：将统一长度的纤维整齐排列制成片状单体，所得片状单体采用浸提法或直接接触法，进行MTT 细胞毒性检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，朱锐钿，田秀梅，聂凤明，阳范文，陈晓明，朱继翔，
申请(专利权)人：广州纤维产品检测研究院，广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44