一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法技术

本发明专利技术公开一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，包括以下步骤：(1)受试物的前处理；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；(5)受试物的分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)受试物的孵育；(9)受试物孵育品的收集；(10)细胞早期凋亡影响率的计算。本发明专利技术对样品检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡的影响。作为卷烟烟气总粒相物细胞毒性检测的补充方法以区别制品对细胞坏死和凋亡的影响。

Method for detecting influence of cigarette smoke total particulate matter on early apoptosis of cells

The invention discloses a method for detection of total particulate matter of cigarette smoke on the effect of early apoptotic cells, which comprises the following steps: (1) pretreatment test; (2) human lung fibroblast cell suspensions were prepared; (3) human lung fibroblast cell concentration calculation of single cell suspension liquid; (4) human lung fibroblast single cell suspension cells; (5) grouping test; (6) subjects were detected dose setting; (7) the culture goods preparation; (8) subjects were incubated (9;) subjects were incubated for collection; (10) to calculate the rate of cell apoptosis in early stage. The invention provides an optimal setting of the sample detection dose and the correct selection of the target cell, so that the method can accurately and effectively detect the influence of the cigarette smoke total particulate matter on the early apoptosis of the cell. Effects of different products on cell necrosis and apoptosis were studied as a supplementary method for the detection of total particulate matter in cigarette smoke.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于烟草制品生物学效应评价
，特别涉及一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法。
技术介绍
细胞凋亡的概念是1972年由Kerr等三位科学家首次提出，虽然细胞凋亡(apoptosis)与细胞坏死(necrosis)的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。对于卷烟烟气总粒相物细胞毒性的检测，国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织推荐采用中性红细胞毒性法，但中性红细胞毒性法存在一定的缺陷。中性红进入细胞并在细胞内聚集的过程要求有完整的细胞膜，而细胞凋亡早期细胞膜表面发生改变，带负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。因此，有必要开发一种用于检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，作为卷烟烟气总粒相物细胞毒性检测的补充方法以区别卷烟烟气总粒相物对细胞坏死和凋亡的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，包括以下步骤：(1)受试物的前处理；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；(5)受试物的分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)受试物的孵育；(9)受试物孵育品的收集；(10)细胞早期凋亡影响率的计算。本专利技术优选的实施方案中，上述方法，包括以下具体步骤：(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；(2)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5非个非零剂量：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL；(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用成纤维细胞培养基将每孔中的液体体积补足到2mL/孔；(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；(9)受试物孵育品的收集：收集步骤(8)中的培养液，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后连同收集的培养液，1000rpm转速下，4℃离心5min，收集细胞；(10)细胞早期凋亡影响率的计算：用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤步骤(9)所得细胞2次，每次均于1000rpm转速下，4℃离心5min，收集细胞，再加入100μL的结合液：重悬细胞，再加入10μL的染料，轻轻混匀，然后避光、室温下反应10min，再加入400μL的重悬细胞进行混匀得到检测样品，在1小时内用流式细胞仪检测，即得到细胞早期凋亡影响率。本专利技术优选的实施方案中，步骤(10)所述的重悬细胞BindingBuffer重悬细胞，该细胞为商品化细胞，可购买于市场任意能购买到的地方。本专利技术优选的实施方案中，所述的染料为AnnexinV-FITC和PI染料，二者的体积比为1:1，二者均为商品化染料，可购买于市场任何能购买到的地方，其中PI染料为碘化丙啶染料。本专利技术有益效果：本专利技术对样品检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡的影响。作为卷烟烟气总粒相物细胞毒性检测的补充方法以区别制品对细胞坏死和凋亡的影响。附图说明图1为受试样品在检测剂量范围内细胞早期凋亡率和检测剂量间存在剂量效应关系图。具体实施方式下面将结合具体实例对本专利技术做详细描述，但并不限制本专利技术。本实施例针对肯塔基参比卷烟3R4F卷烟烟气总粒相物对人肺成纤维细胞早期凋亡影响的测试。(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5非个非零剂量：25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL；(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)受试物的前处理；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；(5)受试物的分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)受试物的孵育；(9)受试物孵育品的收集；(10)细胞早期凋亡影响率的计算。

【技术特征摘要】
1.一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞早期凋亡影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)受试物的前处理；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；(5)受试物的分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)受试物的孵育；(9)受试物孵育品的收集；(10)细胞早期凋亡影响率的计算。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔，接种到6孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：管莹，李雪梅，夭建华，熊国行，米其利，高茜，朱洲海，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53