一种真菌荧光染色的方法及应用技术

一种真菌荧光染色的方法，该方法包括直接将染色液（将直接黄96溶于0.1M的Tris–HCl缓冲液（pH=8.5）中）均匀喷雾在寄主植物叶片表面，以观察病原真菌孢子于寄主植物叶片表面的情况；还包括将病原真菌菌丝侵蚀的叶片浸入沸水浴的95%体积浓度的乙醇中以完全脱除叶绿素；取出叶片，依次用50%体积浓度的乙醇、50mM氢氧化钠、纯水清洗，最后将叶片浸入染色液中染色，以观察病原真菌侵入到寄主叶组织后的情况。如此，由于本方法所用试剂均无毒无害，比起常规脱色方法中用到的氯仿、苯酚、三氯乙酸、吡啶等试剂而言更加安全环保；且本操作方法简单易行，在不影响染色效果的前提下，不仅省略了切片的过程，染色的步骤也大为简化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及荧光染色的方法，具体涉及一种真菌荧光染色的方法，同时还涉及该方法在观察病原真菌入侵过程中的应用。
技术介绍
植物病理学的研宄中经常需要观察病原真菌与寄主植物的相互作用。传统的组织透明染色法可以对组织中病菌菌丝扩展进行定量研宄，揭示寄主和病原物相互作用的时空变化动态。但是，该组织透明染色法的应用具有一定的局限:首先，该法难以区分细胞的病理性坏死和机械创伤，会导致观察结果不理想；其次，对于观察真菌孢子在寄主植物表面的萌发和侵入的过程，该组织透明染色法无法实现。因为组织透明染色法在操作过程当中需要反复漂洗，会将孢子洗脱下来。此外，该组织透明染色法具有操作耗时长、步骤繁琐等缺点。观察真菌孢子萌发入侵的过程中另一种经常使用的方法是通过转基因技术将绿色荧光蛋白基因(GFP)转化到病原真菌中，使该基因在病原真菌中表达，然后在荧光显微镜下观察病菌的形态和活动情况。该法能更准确、快速地观察病菌在寄主植物表面和组织中的行为，是研宄病菌与其寄主之间的相互关系较为理想的方法。然而，该法涉及转基因的操作过程，包括表达载体的构建和遗传转化等过程，耗时更长，且对操作者的技术要求较高，还有不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真菌荧光染色的方法，其特征在于，该方法包括：寄主植物表面病原真菌孢子入侵寄主叶组织前的染色：将染色液均匀喷雾在有病原真菌侵蚀的寄主植物叶片表面；病原真菌菌丝侵入寄主叶组织后的染色：将病原真菌菌丝侵蚀的叶片浸入沸水浴的脱色液中，直至叶片中的叶绿素完全脱除；取出叶片，用50%体积浓度的乙醇清洗2‑3次，每次10‑15分钟，然后用50mM氢氧化钠清洗2‑3次，每次10‑15分钟，接着用纯水清洗2‑3次，每次10‑15分钟，最后将叶片浸入染色液中染色5‑8min；上述脱色液是95%体积浓度的乙醇；上述染色液是将2mg直接黄96溶于100mL 0.1M 的pH值为8.5的Tris–HCl缓冲液中配制...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周倩，刘甜甜，熊兴耀，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43