本发明专利技术为一种非疾病诊断用途的基于硼酸介导的聚合酶链反应检测DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的生化分析方法。本发明专利技术结合葡萄糖基化反应，利用硼酸及其衍生物试剂可与葡萄糖基化5‑羟甲基胞嘧啶中的邻二醇发生的共价作用，显著增加被复制碱基单元的体积，有效抑制聚合酶扩增反应的特点，提出硼酸介导的DNA聚合酶链扩增反应，可特异性地识别特定基因/片段中的5‑羟甲基胞嘧啶。本发明专利技术涉及的方法不受酶切位点限制，可适用于各种生物样品DNA序列中5‑羟甲基胞嘧啶的生化分析鉴定。本方法具有广阔的应用前景，对于进一步阐明5‑羟甲基胞嘧啶的生物学功能具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测
，具体是一种快速、准确、高效检测和定位特定基因 /片段中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒。
技术介绍
5_ 轻甲基胞啼陡（5_hyd;roxymethylcytosine，5hmC)是继 5_ 甲基胞啼陡 (5-methylcytosine，5mC)之后发现的第六种碱基，已在多种哺乳动物组织和细胞中检出。 与5mC相比，5hmC的含量更低（2009年，Heintz研究组利用薄层色谱和质谱等分析方法， 在人、小鼠大脑以及胚胎干细胞中检测到5hmC，皮质和脑干区5hmC表达丰富，浦肯野细胞 中5hmC的含量约占总核苷酸的0. 6%，在颗粒细胞中约占0. 2% ;S. Kriaucionis，N. Heintz, Science，2009, 324 :929-930),但5hmC也同样具有非常重要的生物学功能。 现有的研究已经表明5hmC和TETs参与了基因组重新编程、基因表达的转录调 控，并在DNA去甲基化过程中发挥重要作用。2011年，研究发现TET蛋白可将5hmC转 变成 5_ 甲醜胞啼陡（5-formylcytosine，5fC)和 5_ 羧基胞啼陡（5-carboxylcytosine， 5caC)。此两种碱基修饰产物都可以在基因组DNA中检测到，并且5hmC、5fC和5caC的基 因组含量与TET蛋白的表达量有关。5fC和5caC的发现提示了一种新的主动去甲基化通 路（5mC - 5hmC - 5caC - C)，为研究DNA去甲基化作用及生理功能指明了方向。5mC首先 氧化为 5hmC，并进一步氧化为 5fC 和 5caC (S. Ito, L Shen，Q. Dai，S. C Wu，L Collins， J. A. Swenberg，C. He，Y. Zhang，Science，2011，333 :1300-1303)。而 5fC 和 5caC 可被一种 重要的胸腺嘧啶DNA糖基化酶（Thymine DNA Glycosylase，TDG)识别并切除，形成非碱基 位点，最后通过碱基切除修复通路将非碱基位点修复为正常的胞嘧啶。令人感到意外的是， DNA修复通路不仅负责细胞内的DNA损伤的消除而且参与DNA主动去甲基化。再次证明了 DNA 修复的重要性（Y. F. He，B. Z. Li, Z. Li, P. Liu，Y. Wang，C. He，G. L. Xu，et al.，Science， 2011,333 :1303-1307)。另外，Xu研究组发现TETs蛋白家族中的TET3在卵细胞重新编程 过程中也起到了重要作用（Τ· P. Gu，F. Guo, H. Yang，G. L. Xu，Nature，2011，477 :606-U136); 目前，大量的研究显示5hmC是5mC在去甲基化过程中的一种重要的中间体，实际上，基因组 中5hmC含量较低，与推断其是一种短暂产生的中间体是相一致的。另外，5hmC在基因调控 元件区具有独特的分布特点，研究发现5hmC和5mC都高度富集于基因内部，尤其是外显子 区，只有5hmC在转录起始位点、5'非编码区富集，在其他基因转录调控元件区如增强子、启 动子区域等5hmC表达水平较5mC相对高。综上，5hmC的生物学功能还不是很明确，但是可 以确定的是5hmC和TETs在全基因组的表观遗传重组和组织特异性基因表达的调控中起到 了非常重要的作用。另外，5hmC可能与特定肿瘤的发生密切相关，有可能成为肿瘤早期诊断 的生物标志物。 对5hmC生物学功能的研究离不开高灵敏度、高特异性、高通量的检测方法。相对 于基因组中含量较高的5mC，5hmC含量较低，且两者结构相似，导致传统的用于5mC的检测 方法不能应用于5hmC的检测分析。例如，经典的重亚硫酸盐测序法。基因组DNA经重亚硫 酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶可通过脱氨基和脱磺酸基作用转化为尿嘧啶（U)，再经聚合 酶链反应（PCR)扩增转变成胸腺嘧啶（T)，而5mC经处理后不能转化为胞嘧啶（C)，PCR扩增 后仍为C，从而可将5mC与未修饰的C区分。但是，5hmC由于不能脱氨基而形成5-亚甲基 磺酸胞嘧啶，在重亚硫酸盐测序中5hmC和5mC都不能脱氨基，从而PCR扩增后二者不能产 生序列差异，即5mC和5hmC不能被区分。 基因水平5hmC的检测方法更是多种多样，以目前已经发展成为5hmC检测试剂盒 的限制性内切酶酶解结合PCR技术为例，首先采用T4噬菌体β -葡萄糖转移酶（Τ4β -GT)， 在葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glu)存在下，将葡萄糖基团转移至羟基位置， 从而生成葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶（5ghmC)，使5hmC与胞嘧啶（C)、5mC完全区分开。在 此基础上,进行限制性内切酶MspI酶解，由于葡萄糖基化反应后改变了此种限制性内切酶 的酶切特性，使得含有5ghmC位点的序列在酶解之后得以保留，不含有5hmC位点的序列被 酶解掉；通过PCR技术将保留序列进行扩增，从而达到特定基因水平检测5hmC的目的。该 检测试剂盒受到了酶切位点的限制，即5ghmC位点必须位于酶切位点上才能够被检测，且 不能区分多位点的基因序列。 综上，发展5hmC的特异性检测方法以及相关的快速、准确检测试剂盒成了目前亟 须解决的问题，对于5hmC在基因组中分布特点研究，以及对其生理学功能的深入探讨具有 十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的更有效和简便的检测特定基因/片段中5hmC的 方法和试剂盒。其检测结果为5hmC生物学功能研究，以及相关癌症发病机理研究提供科学 依据。 在本专利技术的第一方面，提供一种检测特定基因/片段中5hmC的方法，包括下列步 骤： 1.利用葡萄糖基化反应，将基因组DNA中5hmC转化成5ghmC，从而与5mC以及C 相区分； 2.利用硼酸或其衍生物试剂和葡萄糖基邻位二醇之间的反应，引入阻碍DNA复制 的基团，从而来抑制特定基因序列片段正常的PCR扩增，使PCR产率降低；另外，在葡萄糖基 化反应基础上，不添加硼酸或其衍生物试剂，则特定基因/片段是正常的PCR扩增，从而在 基因水平实现了对5ghmC的选择性识别；此过程采用实时荧光定量PCR技术检测硼酸或其 衍生物试剂对DNA复制过程的影响（附图1)。 在一个优选例中，所述的基因组DNA需经过紫外分光光度计测定浓度（0D260/280 比值在1. 8-2. 0范围内）和电泳检测(一条清晰的电泳条带，无明显拖尾）完整性。 在另一个优选例中，所述的实时荧光定量PCR反应程序包括：起始95°C预变性2 分钟；循环程序：95°C变性15秒，57°C退火15秒，25°C延伸60秒，共40个循环。 在本专利技术的第二方面，提供一种检测特定基因/片段中5hmC的试剂盒，包括葡萄 糖基化反应试剂、硼酸试剂、实时荧光定量PCR反应试剂、阳性对照探针和阴性对照探针。 在另一个优选例中，所述的葡糖糖基化反应试剂包括：T4噬菌体β -葡萄糖转移 酶、葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖、缓冲溶液。 在另一个优选例中，所述的硼酸试剂包括硼酸、苯硼酸、3-氯苯基硼酸、2- (2'_氯 苄氧基）苯基硼酸、3-(单磺酰本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种聚合酶链反应方法和一种试剂盒，可准确检测DNA中5‑羟甲基胞嘧啶，其特征在于：1）DNA片段中的5‑羟甲基胞嘧啶可被葡萄糖基化；2）非5‑羟甲基胞嘧啶的DNA碱基不能被葡萄糖基化；3）硼酸类化合物可与葡萄糖基化5‑羟甲基胞嘧啶中的顺式邻二醇发生共价作用，并通过这种作用显著抑制含葡萄糖基化5‑羟甲基胞嘧啶DNA片段的复制与扩增；4）DNA的复制与扩增是通过聚合酶链反应；5）如果DNA不含5‑羟甲基胞嘧啶，其复制与扩增则不受硼酸类化合物的影响；6）含5‑羟甲基胞嘧啶DNA与不含5‑羟甲基胞嘧啶DNA的检测分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪海林，赵超，赵柏林，李翠平，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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