一种细菌芽胞功能微球的制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物材料制备领域，涉及一种细菌芽孢功能微球的制备方法与应用。利用新的生化方法处理细菌芽孢，制备高分散性的功能微球，然后将纳米材料固定在处理后的芽孢表面，将其应用于不同的领域。发明专利技术的要点在于，收集培养3～10天浓度为108～1011cfu的细菌芽孢，经离心洗涤和超声处理，用胰蛋白酶液和去芽孢衣处理液处理，最后得到除去孢外壁和芽孢衣的表面光滑的细菌芽孢微球，用此微球负载金属纳米颗粒。本发明专利技术制备的功能微球机械刚性结构更加稳定，负载的纳米材料不易脱落，作为载体的性能更加稳定可靠。本发明专利技术还公开了所制备的芽孢微球在动物免疫检测材料中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物材料制备
，具体涉及一种细菌芽胞功能微球的制备方法 与应用。
技术介绍
功能性单分散微球在微机电系统、光电元件、生物传感器、环境分析和催化剂载体 等方面具有极其广泛的应用前景。聚苯乙烯（polystyrene)是最常用的微球制备材料， 通常采用化学法合成，如：乳胶聚合和沉淀聚合法等。但是，采用传统的搅拌和挤出技术 想要制备外型、尺寸、表面和光学性质均一的微球却不是一件容易的事情。此外，化学合 成方法不可避免地使用到对人体和环境有害的有机试剂等。 在微球表面修饰不同的活性基团如-NH2、-SH、-C00H、-CNm&-〇H等 是制备功能性微球的关键：只有表面接有活性基团的功能性微球才能通过装载不同分子或 材料发挥其独特功能，并最终应用到不同领域。目前，聚苯乙烯微球表面的修饰主要是通过 化学反应（如嫁接和共聚反应）将特定功能基团键合到微球表面，其缺点是：往往需要 多个复杂的处理步骤；在锚定过程中采用的化学试剂往往会对微粒的表面结构等性质等损 伤，对人体和环境也存在潜在的危害等。。因此，发展一种环境友好、操作简单、低成本的 方法，用以大量制备高度均一性功能化单分散微球具有重要的应用价值和研宄意义。 农业微生物中有一类环境友好型芽胞杆菌如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、球 形芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等，他们被广泛被用于制备饲料、肥料及水处理试剂等。由于 芽胞杆菌产生的芽胞表面有弹性，具有厚、坚硬而含水量低的多层结构，因此对热、干燥、辐 射、化学试剂和其他理化因素有较强的抗性，可以保持生命力达数十年之久。研宄结果表明 芽胞可以看成是天然的具有CoreOshell结构的高分子微球，采用"芽胞"微球装载纳米材 料有以下优点：（1)其表面富带有内生的各种活性基团（无需要复杂繁琐的表面活化程序 和复杂的化学组装程序）；(2)可以采用发酵的方式大量生产，生产方式绿色环保、成本低； 生命是一个高度有序的化学反应过程，可确保产生的"微球"的外形、光学特性以及表面性 能上能保持高度统一；（3)芽胞坚硬的外壳可以确保微球性质稳定、不容易崩塌。 金属纳米颗粒由于其优良特性成为当前基础科学和应用研宄的研宄热点。但是， 纳米颗粒大的比表面积和高的碰撞频率，使其具有很大的表面能，出现自发聚集倾向，从而 影响纳米颗粒的稳定性，并最终失去固有的活性。此外，纳米颗粒的使用过程会导致意 外的泄露和污染，且成本高，不便操作。将纳米材料固定到功能化单分散微球表面形成纳米 复合材料不仅可以克服上述局限，并有可能由于协同效应产生新的性质和潜在应用前景。 基于芽胞的独有特性，本专利技术探索出一种基于生物发酵的方法制备功能性单分散微球的新 方法，分别在芽胞微球表面装载不同金属纳米材料，并成功用于催化有机化学反应及免疫 分析测定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种新的生化方法处理细菌芽胞， 制备高分散性的功能微球，然后将纳米材料固定在处理后的芽胞表面，将其应用于不同的 研宄领域。 为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案： 首先将培养3~10天的浓度在IO8~1011Cfu的细菌芽胞收集起来，经过离心洗涤 后再进行超声处理，然后用胰蛋白酶液处理和去芽胞衣缓冲液（Decoating buffer)处 理，最后得到除去胞外壁和芽胞衣的表面光滑的细菌芽胞微球，然后用此微球负载金属纳 米颗粒用于实际应用研宄。 具体地，本专利技术的技术方案如下所述： 一种利用细菌芽胞制备功能微球的方法，包括下列步骤： ⑴配制LB液体培养基和LB固体培养基，将所述的培养基在121°C灭菌30min，用 LB液体培养基活化细菌芽胞杆菌4-6h，当OD6tltl= 0. 6时，向每个培养皿加入200uL活化好 的菌液并涂布均匀，然后在37°C培养箱中培养，收集培养3-10d的芽胞，用去离子水洗涤并 离心，重复2-5次； (2)用去离子水将芽胞重悬，将IO8-IO11个/mL的芽胞分装在离心管中，调整超声 波细胞破碎仪的输出功率至220W~450W，振幅为0 % -70 %，超声处理10-30min，所述的超 声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min停3min ; (3)将上步处理的芽胞用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽胞在以pH 3的 盐酸溶液或pH 7. 4的0.0 lM的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含0. 5-2. 0 %的胰蛋白酶溶 液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3~5次； (4)配制与芽胞悬液等体积的去芽胞衣处理液（Decoating Buffer)并将芽胞重 悬，在37~80°C水浴中搅拌处理0. 5-4h，将处理后的芽胞用适量的去离子水重悬，得到芽 胞微球； (5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为IO8-IOltl个/mL的芽胞悬液 混合后于120~140rpm，37°C，恒温摇床中振荡孵育0. 5-2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在芽 胞表面，形成芽胞@金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未 吸附的金属纳米颗粒。 其中： 所述的芽胞杆菌是巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium)、枯草芽胞杆菌 (Bacillus subtilis)或解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)。 所述的金属纳米颗粒选自胶体金、胶体银、胶体铂、胶体钯或立方钯。 所述的金属纳米颗粒的粒径分别如下所示：胶体金粒径为15nm，胶体银粒径为 l〇-15nm，胶体钼粒径为5nm，胶体钮粒径为5nm，立方钮粒径为20_30nm。 申请人提供了一种利用细菌芽胞制备的功能微球的应用方法，包括下列步骤： (1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将配制的培养基在121°C灭菌30min，用 LB液体培养基活化细菌芽胞杆菌4-6h，当OD6tltl= 0. 6时，向每个培养皿加入200uL活化好 的菌液并涂布均匀，然后在37°C培养箱中培养，收集培养3~IOd的芽胞，用去离子水洗涤 并离心，重复2-5次； (2)用去离子水将芽胞重悬，将IO8~10 11个/mL的芽胞分装在离心管中，调整超 声波细胞破碎仪的输出功率为220-450W，振幅为0% -70%，超声处理10~30min，所述的 超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min停3min ; (3)将超声处理结束的芽胞用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽胞在以pH 3的盐酸溶液或pH 7. 4的0.0 lM的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含0. 5-2. 0 %的胰蛋白 酶溶液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3-5次； (4)配制与芽胞悬液等体积的去芽胞衣处理液（Decoating Buffer)并将芽胞重 悬，在37-80°C水浴中搅拌处理0.5h-4h，将上述处理后的芽胞用适量的去离子水重悬，得 到芽胞微球；（5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为IO8-IOltl个/mL的芽胞悬 液混合后于120~140rpm，37°C，恒温摇床中振荡孵育0. 5-2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在 芽胞表面，形成芽胞@金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除 未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用细菌芽孢制备功能微球的方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将所述的培养基在121℃灭菌30min，用LB液体培养基活化细菌芽孢杆菌4～6h，当OD600＝0.6时，向每个培养皿加入200uL活化好的菌液并涂布均匀，然后在37℃培养箱中培养，收集培养3～10d的芽孢，用去离子水洗涤并离心，重复2～5次；(2)用去离子水将芽孢重悬，将108～1011个/mL的芽孢分装在离心管中，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220～450W，振幅为00％～70％，超声处理10～30min，所述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min停3min；(3)将上步处理的芽孢用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽孢在以pH 3的盐酸溶液或pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含0.5～2.0％的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3～5次；(4)配制与芽孢悬液等体积的去芽孢衣处理液(Decoating Buffer)并将芽孢重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5～4h，将处理后的芽孢用适量的去离子水重悬，得到芽孢微球；(5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为108～1010个/mL的芽孢悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育0.5～2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在芽孢表面，形成芽孢@金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的金属纳米颗粒。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡涌刚，项玉强，曾志明，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42