沃尼妙林前药及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种沃尼妙林前药及其制备方法和检测方法，本发明专利技术所提供的沃尼妙林前药具有良好的稳定性，克服了沃尼妙林半衰期只有1.3～2.7小时的缺点，制备的前药具有缓控释作用，体外释放实验显示沃尼妙林前药在8h达到了最大值。由于沃尼妙林分子具有多个活性反应位点，本前药制备时载体与沃尼妙林连接的反应位点确定方法是采用单分子载体与沃尼妙林反应的方法，获得的单分子前药经核磁检测确定沃尼妙林的反应位点，本方法获得的前药反应位点为沃尼妙林的2位氨基；采用的制备方法能够制得载药量较高的沃尼妙林前药；制备的前药采用UV、HPLC-UV和HPLC-ELSD联用的方法测定PEG-沃尼妙林前药的载药量，使测得的载药量更加准确。本发明专利技术适用于沃尼妙林前药的制备和检测。

【技术实现步骤摘要】
沃尼妙林前药及其制备方法和检测方法
本专利技术属于制药领域，涉及一种前药及其制备方法和检测方法，具体涉及一种沃尼妙林前药及其制备方法和检测方法。
技术介绍
沃尼妙林属于截短侧耳素类兽用抗生素，它主要是作用于细菌50S核糖体亚基，通过抑制肽基转移酶的活性而使细菌蛋白质合成受阻，从而实现抑菌作用。沃尼妙林抗菌谱广，对G+、G-和支原体菌均有作用，对链球菌、葡萄球菌、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、猪痢疾短螺旋体、结肠菌毛样短螺旋体、猪胸膜肺炎放线杆菌和细胞内劳森菌等均有较强的抑制作用，尤其是对支原体和螺旋体属高度敏感。沃尼妙林本身的水溶性和稳定性都很差，通常需要将其制备成沃尼妙林盐酸盐来提高其水溶性和稳定性。沃尼妙林的盐酸盐水溶性好，口服吸收快，但其味苦、粉末刺激性强、对光不稳定、吸湿性强、半衰期只有1.3～2.7小时，不能使药物正常发挥作用，因此制备其缓控释剂型有利于提高药物的稳定性和半衰期，同时能够使其实现长期药效，减少给药次数。前药(Prodrug)是指具有药理活性的药物与某种化学基团、片段或分子(载体)经共价键连接形成暂时性键合或永久性键合的化合物。所形成的新化学实体，本身没有活性，进入人体后，在体内经酶促或非酶促反应会释放出活性原药，从而产生药效。合理的前药可以增加活性药物在体内的水溶性和代谢的稳定性，酶促或非酶促反应需要时间，因此会延长药物的作用时间，同时可以借助于前药载体而使药物在某些特定靶组织中定位，减少副作用，提高药物作用的选择性及疗效。是否可以成功地设计出前药在一定程度上取决于载体分子的选择，所以载体分子的发展不断地推动着前药的快速发展。聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)为线性结构，具有良好的水溶性和生物相溶性，无毒、无免疫性、无致畸性且无抗原性，是获得FDA批准的药用合成聚合物之一。PEG聚合物是已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物，当PEG被连接到药物分子上时，便将其本身具有的高度亲水性和较大的水动力学体积等优良性质赋予给了被修饰的药物分子，改变了药物在水溶液中的溶解性和生物分配行为，高聚物分子同时在其修饰的药物周围产生较大的空间屏障，减少药物的快速降解，实现缓控释作用，因此研究一种具有缓控释作用的沃尼妙林前药具有重要的意义。PEG的分子量为2000～75000，分子量比较大，为复杂的混合物，大分子沃尼妙林的分子量为564.8，沃尼妙林前药得到的核磁图谱可能难以分析，看不清甚至找不到原来的结构，因此研究一种能够检测沃尼妙林前药的方法是具有重要意义的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，是提供一种沃尼妙林前药及其制备方法及检测方法，所提供的沃尼妙林前药具有良好的稳定性，克服了沃尼妙林半衰期只有1.3～2.7小时的缺点，制备的前药具有缓控释作用，体外释放实验显示沃尼妙林前药在8h达到了最大值。本专利技术的另一个专利技术目的是提供了沃尼妙林前药的制备方法，能够制得载药量较高的沃尼妙林前药。本专利技术的另一个专利技术目的是提供了沃尼妙林前药的检测方法，由于沃尼妙林分子具有多个活性反应位点，沃尼妙林前药制备时PEG/mPEG与沃尼妙林连接的反应位点确定方法是采用单分子载体与沃尼妙林反应的方法，获得的单分子前药经核磁检测确定沃尼妙林的反应位点，最终确定获得的前药反应位点为沃尼妙林的2位氨基；并用UV、HPLC-UV和HPLC-ELSD联用的方法测定PEG-沃尼妙林前药的载药量，测得的载药量更加精准。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：一种沃尼妙林前药，其分子结构如下；其中，所述的PEG或mPEG修饰剂为或；其中，。作为本专利技术的一种限定，所述的修饰剂中PEG或mPEG的分子量为2000～75000。本专利技术还提供给了制备上述沃尼妙林前药的方法，它按照以下步骤顺序进行：（1）PEG或mPEG修饰剂的制备将干燥的PEG或mPEG加到甲苯中，加入吡啶，加热至60℃；另将丁二酸酐在60℃下溶于甲苯中；将溶解后的丁二酸酐缓慢滴入溶解后的PEG或mPEG中，在60℃反应1h，温度升至80℃反应36h;反应完毕蒸去溶剂,加入饱和NaHCO3溶液搅拌30min,乙酸乙酯萃取,水相用稀盐酸调pH=2～3，二氯甲烷萃取,二氯甲烷层水洗至pH=6～7，干燥,浓缩至1/5溶剂量,然后向浓缩物中缓慢加入无水乙醚，搅拌30min，降至室温后继续搅拌30min，于0℃下冷冻2h，过滤，冷冻干燥，得末端羧基的PEG或mPEG衍生物；将末端羧基的PEG或mPEG衍生物溶于体积比为1:1的DMF和CH2Cl2混合溶剂中，温度降至0～5℃，加入活化试剂和碱性催化剂反应1h，升至室温反应4～12h，反应完毕，减压浓缩至1/5溶剂量，向浓缩物中加入无水乙醚，于0℃下冷冻2h，过滤，冷冻干燥，得PEG或mPEG修饰剂；（2）沃尼妙林前药的制备将末端羧基的PEG或mPEG衍生物或PEG或mPEG修饰剂溶于体积比为1:1的无水乙醇和二氯甲烷的混合溶剂中，温度降至0～5℃，按照顺序分别加入沃尼妙林、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶,搅拌30min，自然升至室温，继续搅拌反应12h，反应完毕，加入10%的HAc溶液,二氯甲烷萃取,合并有机层，水洗至pH=6～7，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干,向残余物中加入体积比为1:1的甲基叔丁基醚和乙醚的混合溶剂中，室温搅拌30min，然后在0℃下冷冻4h，过滤，滤饼用体积比为1:1的甲基叔丁基醚和乙醚的混合溶剂洗涤3次，冷冻干燥，得沃尼妙林前药。作为本专利技术的一种限定，所述的步骤（1）中PEG或mPEG与丁二酸酐的反应摩尔比为1：2.5～10。作为本专利技术的另一种限定，所述的步骤（1）中末端羧基的PEG或mPEG衍生物与活化试剂的反应摩尔比为1：4～8；其中，活化试剂为能与末端羧基的PEG或mPEG衍生物形成酸酐、酰氯或酯的化合物。作为上述限定的进一步限定，所述的能与PEG或mPEG衍生物形成酸酐、酰氯或酯的化合物为：中的一种。作为本专利技术的第三种限定，所述的步骤（1）中的碱性催化剂为吡啶、DMAP或Et3N中的一种。作为本专利技术的第四种限定，所述的步骤（2）中PEG或mPEG衍生物与沃尼妙林的反应摩尔比为1：4～10。本专利技术采用先用小分子乙二醇单甲醚或乙二醇与沃尼妙林反应，通过核磁图找到沃尼妙林的反应位点，再参照其反应条件，确定沃尼妙林与大分子的PEG或mPEG的连接位点。本专利技术还提供了检测上述沃尼妙林前药的方法，采用单分子载体与沃尼妙林反应的方法，获得的单分子前药经核磁检测确定沃尼妙林的反应位点，确定前药制备成功后，再采用UV、HPLC-UV和HPLC-ELSD联用的方法测定PEG-沃尼妙林前药的载药量。首先用HPLC-UV测得沃尼妙林的标准曲线；HPLC-ELSD测得PEG或mPEG、末端羧基的PEG或mPEG衍生物的标准曲线；其次用UV测定最终制得的沃尼妙林前药混合物（包括沃尼妙林前药、未反应的沃尼妙林、PEG或mPEG、末端羧基的PEG或mPEG衍生物）；最后将UV测定的量减去HPLC-UV测得沃尼妙林的量再减去HPLC-ELSD测得PEG或mPEG、末端羧基的PEG或mPEG衍生物的量最终得出沃尼妙林前药的量。作为本专利技术的一种限定，所述的UV条件为：210nm，95%乙醇作为参本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沃尼妙林前药，其特征在于：其分子结构如下；其中，所述的PEG或mPEG修饰剂为或；其中，。

【技术特征摘要】
1.一种沃尼妙林前药，其特征在于：其分子结构如下；其中，所述的PEG或mPEG修饰剂为或；其中，;制备上述沃尼妙林前药的方法，按照以下步骤顺序进行：（1）PEG或mPEG修饰剂的制备将干燥的PEG或mPEG加到甲苯中，加入吡啶，加热至60℃，得A，即溶解后的PEG或mPEG；另将丁二酸酐在60℃下溶于甲苯中,得B，即溶解后的丁二酸酐；将B缓慢滴入A中，在60℃反应1h；然后，温度升至80℃反应36h;反应完毕蒸去溶剂，加入饱和NaHCO3溶液搅拌30min，乙酸乙酯萃取，水相用稀盐酸调pH=2～3，二氯甲烷萃取，二氯甲烷层水洗至pH=6～7，干燥，浓缩至1/5溶剂量，然后向浓缩物中缓慢加入无水乙醚，搅拌30min，降至室温后继续搅拌30min，于0℃下冷冻2h，过滤，冷冻干燥，得C；将C溶于体积比为1:1的DMF和CH2Cl2混合溶剂中，温度降至0～5℃，加入活化试剂和碱性催化剂反应1h，升温至室温反应4～12h；反应完毕，减压浓缩至1/5溶剂量，向浓缩物中加入无水乙醚，于0℃下冷冻2h，过滤，冷冻干燥，得D；（2）沃尼妙林前药的制备将C或D溶于体积比为1:1的无水乙醇和二氯甲烷的混合溶剂中，温度降至0～5℃，依次加入沃尼妙林、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，搅拌30min，自然升至室温，继续搅拌反应12h，反应完毕，加入10%的HAc溶液，二氯甲烷萃取，合并有机层，水洗至pH=6～7，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至干，向残余物中加入体积比为1:1的甲基叔丁基醚和乙醚的混合溶剂中，室温搅拌30min，然后在0℃下冷冻4h，过滤，滤饼用体积比为1:1的甲基叔丁基醚和乙醚的混合溶剂洗涤3次，冷冻干燥，得沃尼妙林前药。2.根据权利要求1所述的沃尼妙林前药，其特征在于：PEG或mPEG的分子量为2000～75000。3.根据权利要求1所述的沃尼妙林前药，其特征在于：所述的步骤（1）中PEG或mPEG与丁二酸酐的反应摩尔比...

【专利技术属性】
技术研发人员：张越，徐世霞，杨吉霞，宋永兴，赵树春，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：河北;13