一种西曲瑞克的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种西曲瑞克的固相合成方法，该方法完全避免了D-瓜氨酸侧链乙酰化的[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克有毒杂质。本发明专利技术方法以氨基树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次连接西曲瑞克序列中相对应的Fmoc-氨基酸，经缩合反应及脱保护反应，得到全保护西曲瑞克肽树脂；再进行酸解切割和乙醚沉降，得到西曲瑞克粗肽；经色谱纯化、醋酸转盐以及冷冻干燥得到醋酸西曲瑞克。本发明专利技术选用Ac-D-2Nal-OH作为最末位氨基酸的连接，以避免乙酰化封端。本发明专利技术工艺既可以采用固相合成也可以采用液相合成，工艺副产物少，易于分离纯化。所得最终的醋酸西曲瑞克产物纯度高达99％，收率高达40％，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于多肽药物制备方法
，特别涉及一种西曲瑞克的固相合成方 法。
技术介绍
西曲瑞克(商品名Cetrotide)是一种有效的黄体酮释放激素抑制素（LH-RH)受体 拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。并可用于治疗乳 腺癌和妇科癌，子宫内膜异位症，性早熟，子宫子宫肌瘤，卵巢雄激素过多和经前综合症。 西曲瑞克被用于辅助生殖抑制过早促黄体激素激增。药物作用机理是由于阻断促 性腺激素释放激素的作用，从而迅速抑制黄体生成激素（LH)和卵泡刺激素（FSH)的产生和 作用。西曲瑞克用于治疗对激素敏感的前列腺癌和乳腺癌和一些良性妇科疾病(子宫内膜 异位症，子宫肌瘤和子宫内膜变薄)。西曲瑞克通过剂量依赖抑制脑垂体腺的黄体生成激素 (LH)和卵泡刺激素（FSH)的分泌，抑制作用是直接的，并通过连续的治疗来维持，不引起黄 体激素受体活性在初始时高涨随后下调。西曲瑞克的治疗采用每天多次〇. 25毫克皮下注 射或作为单剂量为3mg皮下注射。大量研宄表明，西曲瑞克对卵巢癌、前列腺癌、子宫纤维 瘤、子宫内膜异位等疾病有较好的疗效，而且对良性前列腺肥大和卵巢过度刺激综合征有 预防和改善作用。 西曲瑞克是一种合成的十肽，其分子结构如结构1 : 西曲瑞克的氨基酸序列为： AcnNallHci-Phe2-D-SPal3-Ser4-Tyr 5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala 1c1-NH20 其中氨基酸的缩写分别为： D-2Nal: D-2-萘丙氨酸 D-4C1-Phe: D-4-氯-苯丙氨酸 D-3Pal: D-3-吡啶丙氨酸 Ser:丝氨酸 Tyr:酪氨酸 D-Cit: D-瓜氨酸 Leu:亮氨酸 Arg:精氨酸 Pro:脯氨酸 D-Ala: D-丙氨酸。 有许多已知的方法可用于多肽药物的合成。液相多肽合成（LPPS)-直是生产大 量多肽的优选方法，另一种目前常用的多肽合成方法是固相多肽合成法（SPPS)，其中所 需肽链从C末端开始在树脂上依次进行氨基酸的连接。在这些方法中的氨基酸的侧链需要 进行保护，以避免其他侧链副反应。 专利CN101284863B公开了西曲瑞克的一种Fmoc固相合成方法。该方法包括以 下步骤：Fmoc Linker MBHA树脂被用作起始原料，并依次连接N-末端Fmoc保护的氨基 酸，以获得全保护的十肽树脂；苯并三氮唑_Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟 基苯并三氮唑或N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基苯并三氮唑作为偶联剂，偶联反应在 35-50摄氏度下进行0.5 - 2小时；多肽连接完成后使用乙酸酐进行乙酰化封端；然后进 行三氟醋酸树脂切割和侧链脱保护，粗肽用反相C18或C8色谱柱纯化并冷冻干燥，得到西 曲瑞克。由于瓜氨酸残基的侧链没有采用保护基团，可以在乙酰化反应过程中发生侧链 的乙酰化副反应，以形成-西曲瑞克工艺杂质（见结构2和结构3)，其序列为 AcuNal1HCl-Phe2-D-SPal3 -Ser4-Tyr5-D-Cit (Ac) 6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala lcl-NH2，它是 一种毒性较大的杂质，用现有技术的手段很难除去，该杂质的存在严 重影响西曲瑞克的含量以及使用安全。因此，这种方法制备西曲瑞克容易产生有毒杂质， 不适用于工业化大规模合成西曲瑞克。此外，所述氨基酸偶联反应温度为35-50摄氏度， 氨基酸在这样的高温下，容易发生消旋从而影响产品的光学纯度。 D-瓜氨酸侧链被乙酰化的-西曲瑞克杂质的两种可能结构(结构2和 结构3): 专利CN104086632A公开了西曲瑞克的另一种Fmoc固相合成方法。该方法包括以 下步骤：1) AM树脂用作初始树脂依次连接N-末端Fmoc保护的氨基酸，以获得全保护的十 肽树脂，其中所述肽序列6-位氨基酸连接使用的Fmoc-D-Orn (Dde)-OH; 2)当偶联完成后， 去除Fmoc保护基团，并进行N-端乙酰化封端；3)用水合肼/N，N-二甲基甲酰胺3:97体 积比的溶液去除D-鸟氨酸侧链Dde保护基；然后加入叔丁基异氰酸酯，将多肽中D型鸟氨 酸转换为瓜氨酸，从而得到全保护的西曲瑞克肽树脂；4)将肽树脂进行三氟醋酸裂解，纯 化，盐交换，并冻干以获得西曲瑞克。采用这种制备方法，-西曲瑞克杂质的含 量小于0. 1 %。但是，这种方法需要使用Dde保护基的Fmoc-D-Orn (Dde) -OH以及有毒的水 合肼试剂用来除去Dde保护基，并将D-鸟氨酸转化成D-瓜氨酸。此制备工艺复杂，不适用 于工业化西曲瑞克的制备。 专利CN104277093A公开了西曲瑞克的一种Fmoc化学和微波加热相结合的固相合 成方法。该方法包括以下步骤：Rink Amide-AM树脂被用作起始原料，并依次加上N-末端 Fmoc保护的氨基酸，以获得全保护的十肽树脂；采用N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基 苯并三氮唑作为偶联剂，偶联反应用微波加热进行；多肽连接完成后使用乙酸酐进行乙酰 化封端；然后进行三氟醋酸树脂切割和侧链脱保护，然后进行三氟醋酸树脂切割和侧链脱 保护，粗肽用反相C18色谱柱纯化并冷冻干燥，得到西曲瑞克。由于此方法也使用了侧链没 有保护基的Fmoc-Cit-ΟΗ，同样无法避免有毒-西曲瑞克杂质的产生，微波加 热的方法也不适用于工业化制备合成。 专利CN101863960B公开了西曲瑞克的一种Boc固相合成方法。该方法包括以下 步骤：使用的Boc氨基酸和Wang树脂为原料，依次连接Boc氨基酸。多肽连接完成后，使用 10%重量比的氨水进行氨解切割，然后使用H2/钯除去侧链保护基以获得粗肽。该粗肽通过 反相C18色谱柱纯化，得到西曲瑞克。此Boc固相合成法采用大量的三氟醋酸除去Boc保 护基以及氨水用于氨解切割，对环境污染大。另外，使用H 2/钯进行侧链脱保护，可能会导 致最终产品的重金属污染。 因此，目前迫切需要一种能够避免-西曲瑞克有毒杂质，且安全高效 和环境污染小的生产方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，主要解决现有固相合成法中有 毒且难分离的D-瓜氨酸侧链被乙酰化的-西曲瑞克工艺杂质问题，及现有固 相合成法使用有毒试剂从而导致环境污染以及产品中可能有重金属污染的问题。本专利技术以 最少保护基的原则快速制备，得到理想的合成结果。 D-瓜氨酸侧链被乙酰化的-西曲瑞克杂质是一种毒性较大的工艺杂 质，它的产生是由于侧链未受保护的瓜氨酸被用于偶联反应，在最后的多肽封端过程中，瓜 氨酸的侧链也被部分乙酰化。由于-西曲瑞克杂质有毒并且难以纯化，杂质的 存在极大地影响了产品的安全性和工艺效率。为了避免这种杂质，专利CN104086632A公开 的固相Fmoc法，其中所述肽序列6-位氨基酸偶联使用Fmoc-D-Orn (Dde) -OH。完成多肽连 接和Ac封端以后，用水合肼除去D-鸟氨酸侧链Dde保护基，然后加入叔丁基异氰酸酯把鸟 氨酸转化为瓜氨酸。尽管-西曲瑞克杂质能够有效地控制在0.1 %以下，但该 方法需要采用侧链Dde保护的鸟氨酸Fmoc-D-Orn (Dde) -OH，完成多肽连接后用有毒的水合 肼试剂去除Dde保护基，并将鸟氨酸转化成为瓜氨酸，此本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备西曲瑞克的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：a) 以氨基树脂为固相载体，通过固相合成法依次偶联西曲瑞克序列中相对应的Fmoc‑保护氨基酸，最后一个氨基酸的连接采用Ac‑D‑2Nal‑OH，制备得到侧链部分保护或全保护的西曲瑞克肽树脂；b) 使用酸解切肽试剂对所述肽树脂进行切割及侧链去保护。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李湘，徐琪，魏忠勇，
申请(专利权)人：中肽生化有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33