一种胰高血糖素的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种固相片段法制备胰高血糖素的方法。本发按照序列利用固相合成法逐个连接5‑29片段，然后将四肽片段Fmoc‑His(Trt)‑Ser(tBu)‑Gln(Trt)‑Gly‑OH连接至5‑29片段肽树脂上，酸解脱除保护基及切肽得到胰高血糖素粗品，经纯化、冻干后得到胰高血糖素纯品。本发明专利技术具有易于合成、杂质含量少且节约成本的优点。

A preparation method of glucagon

【技术实现步骤摘要】
一种胰高血糖素的制备方法
本专利技术涉及多肽药物制备领域，尤其是涉及一种固相片段法制备胰高血糖素的方法。
技术介绍
胰高血糖素(glucagon)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，它是由29个氨基酸组成的直链多肽，亦称胰增血糖素或抗胰岛素或胰岛素B，与胰岛素相对抗，起着增加血糖的作用，1953年，胰高血糖素被分离沉淀而取得结晶。其化学结构为H-His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29-OH，分子量为3485道尔顿。胰高血糖素是一种比较难制备的29肽，特别是在N端末端几个氨基酸的连接中。迄今为止报道制备胰高血糖素的篇幅很少。专利CN1063795C报道了首先制备胰高血糖素融合蛋白，然后用酶处理并回收以生产胰高血糖素的方法。专利CN103333239B报道了一种胰高血糖素的固相合成方法，该方法以固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法在较高温度下依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽，在连接过程中，使用了伪脯氨酸保护二肽进行氨基酸缩合。该专利采用高温技术方案的原因，在于解决合成速度慢、反应时间长的问题，从而更加适合工业化生产。然而在较高温度下的反应，及其可能会引起多肽合成中副反应的大量增加。所以该专利进一步采用了伪脯氨酸保护二肽的技术方案，以期减少副反应。但是，伪脯氨酸保护二肽作为一种特殊氨基酸，价格较普通氨基酸昂贵，对于多肽合成当中的成本控制不利，不利于规模化生产。而且，N端末端几个氨基酸的连接中，由于连接难度的增加，每一个氨基酸的固相合成过程，都会增加副反应，而且与接近末端，副反应越多，这每一个步骤的副反应会步步累积，这样的结果，造成了最终产物纯度低。从另外一个角度来说，末端几个氨基酸连接的难度也很高，而且越接近末端越高，该专利为代表的现有技术没有解决这些问题。
技术实现思路
有鉴于此，开发一种易于合成、杂质含量少且节约成本的胰高血糖素制备方法十分必要。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种胰高血糖素的制备方法，包括：步骤1)按照序列利用固相合成法逐个连接5-29片段，得到H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂。步骤2)将四肽片段Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，脱除Fmoc保护后，得到H-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂。或者，将四肽片段Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，得到Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂。步骤3)酸解脱除保护基及切肽得到胰高血糖素粗品，经纯化、冻干后得到胰高血糖素纯品。作为优选，步骤1)合成5-29肽树脂片段使用的树脂为Wang树脂，其初始肽树脂Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂取代度为0.2～0.5mmol/g。作为优选，步骤2)中采用四肽片段Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH或Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH，有效避免了末端几个氨基酸难以连接的问题及His1位点消旋杂质的问题。作为优选，步骤1)和步骤2)中使用的偶联试剂为HOBt、HOAt与DIC的混合物，或PyAop、PyBop与有机碱的混合物，或HBTU、HATU与有机碱的混合物。其中，有机碱选自DIPEA、Et3N、NMM中的一种。更优选为HOBt与DIC的组合。作为优选，步骤3)中所用的裂解试剂包括三氟乙酸，茴香硫醚，苯甲醚，三异丙基硅烷，苯酚，1,2-乙二硫醇，水等。更为优选，裂解试剂的比例为三氟乙酸:苯甲醚:苯酚:1,2-乙二硫醇:水＝90:5:3:2。本专利技术相比现有技术而言，具有以下的优点和进步：在研究过程中我们发现，使用固相逐步法多肽合成策略合成胰高血糖素的过程中，当连接至Gly4时，氨基酸连接变得困难，特别是末端His1的连接特别困难，需要增加氨基酸的投料倍数或者延长反应时间，His1位点的消旋杂质显著增加。这对于后期纯化过程中的杂质分离及最终成品中的杂质控制非常不利。解决胰高血糖素末端几个氨基酸的连接困难问题及控制His1位点的消旋问题，成为合成过程中的难点。因此本专利技术经过多次设计和试验，采用了固相逐步法连接5-29片段，再将1-4片段作为四肽，用固相合成方法连接至肽链中。1-4片段可作为四肽起始物料，相应位点的杂质能通过起始物料的质量标准加以控制，从而解决了传统方法中的消旋杂质问题。同时，使用1-4片段的四肽，反应可以在常温下反应，减少了副反应。也无需引入有毒试剂。本专利技术的方法，反应工艺合理，速度快，副反应少，杂质可控，适合工业化大规模生产。具体实施方式本专利技术实施例公开了一种胰高血糖素的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，进行包括分段方法以及缩合条件等工艺参数的改进。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术内。本专利技术的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。实施例1：本实施例采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成胰高血糖素的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：/n步骤1)按照胰高血糖素氨基酸序列C端到N端的顺序，在偶联试剂的作用下利用固相合成法逐个连接5-29片段，得到H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂；/n步骤2)将四肽片段Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，脱除Fmoc保护后，得到H-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂，或者，将四肽片段Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，得到Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂；/n步骤3)将步骤2)得到的树脂酸解脱除保护基及切肽得到胰高血糖素粗品；/n步骤4)将步骤3)得到的胰高血糖素粗品经制备液相色谱纯化，得到纯化品；/n步骤5)将步骤4)得到的纯化品冻干后得到胰高血糖素的纯品，完成合成。/n...

【技术特征摘要】
1.一种合成胰高血糖素的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
步骤1)按照胰高血糖素氨基酸序列C端到N端的顺序，在偶联试剂的作用下利用固相合成法逐个连接5-29片段，得到H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂；
步骤2)将四肽片段Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，脱除Fmoc保护后，得到H-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂，或者，将四肽片段Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-OH连接至上述5-29片段肽树脂上，得到Boc-His(Trt)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宝生，马佳颀，李湘，徐琪，
申请(专利权)人：中肽生化有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33