本发明专利技术提供了一种天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用。通过对雪莲细胞的转录组测序，并对测序结果进行分析和筛选得到SiPAL基因。该基因的cDNA长度为2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用该基因与植物表达载体相连接得到的SiPAL重组表达载体，制备得到该酶，可以应用于以L-苯丙氨酸为底物制备肉桂酸。利用本发明专利技术可以通过基因工程技术提高天然药效成分紫丁香苷的含量，尤其是在雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶（SiPAL)基因 及其编码产物和应用。
技术介绍
天山雪莲（Saussurea involucrata)系菊科风毛菊属植物，主产于新疆天山、昆仑 山，生长在雪线以上，民间以全草入药，具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳等功效，用于治 疗风湿性关节炎、肺寒咳嗽、闭经、胎衣不下、阳瘘等疾患 。由于天山雪莲生长环境特异、 人工栽培困难，雪莲细胞成为天山雪莲的替代品之一。雪莲细胞中主要含有紫丁香苷等木 质素类成分 ，其生物合成途径的第一个关键酶就是苯丙氨酸解氨酶。苯丙氨酸解氨酶 (Phenylalanin ammonia-lyase，PAL)为催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶，是这个途 径的关键酶和限速酶，它在木质素、香豆素、类黄酮、黄酮醇、异黄酮和花青素等次生代谢产 物合成中起重要作用。它的功能是催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进一步转化为香豆 素、绿原酸，也可以形成CoA酯，再进一步转化为紫丁香苷等木质素。天山雪莲细胞苯丙氨 酸解氨酶（SiPAL)基因的克隆，为利用基因工程提高雪莲细胞活性成分紫丁香苷含量提供 重要基础。 在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利技术中所提及的天山雪莲苯丙 氨酸解氨酶基因及其氨基酸序列。 参考文献： 国家药典委员会.《中华人民共和国药典》2010年版（一部）·北京：化学工 业出版社，2010:50-51. 李君山，蔡少青.雪莲花类药材的化学和药理研宄进展.中国药学杂 志，1998, 33(8) :449-452 李燕，郭顺星，王春兰，等.天山雪莲细胞培养物化学成分研宄.中国药 学杂志，2008, 42 (23) : 1768-1769. 陈日道.天山雪莲培养物的化学成分及紫丁香苷含量研宄.沈阳：沈阳药 科大学，2009.
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中存在的上述问题，提供由天山雪莲（Saussurea involucrata)细胞中克隆的天山雪莲苯丙氨酸解氨酶（SiPAL)基因，该基因 cDNA的长度为 2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。 本专利技术的另一方面在于公开上文所述的SiPAL基因所编码的蛋白质，其氨基酸序 列如SEQ ID NO : 2所示。 本专利技术的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因的扩增引物，其序列如SEQ ID NO : 3~4所示。 本专利技术的另一方面在于公开含有上文所述SiPAL基因重组表达载体。本专利技术所 提供的SiPAL基因，连接于可以引导外源基因在植物表达中的表达载体制备得到SiPAL基 因重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒PET-31M+)。本专利技术的SiPAL基因 在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导性启动子均 可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细 胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常 可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是⑶S、GFP等可以产生颜 色变化的酶或发光化合物的基因等。 本专利技术的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因的宿主细胞。优选地，该宿主细 胞含有以上所述的含有SiPAL基因的重组表达载体。在本专利技术的技术方案中，所述的宿主 细胞优选采用E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21等细胞。 本专利技术的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因在雪莲细胞或组织培养中的应 用，具体可以应用于生物法合成木质素类成分的制备。进一步，所述木质素类成分为天山雪 莲的重要有效成分紫丁香苷。 本专利技术所述的天山雪莲细胞是按照申请号为200510115902. 0的专利技术专利中记载 的方法获得，是选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种，给与一定条件进 行大规模继代培养获得的紫红色团块。 本专利技术的有益效果：本专利技术成功从雪莲细胞中克隆出了一种天山雪莲苯丙氨酸解 氨酶（SiPAL)基因，该酶可以应用于以L-苯丙氨酸为底物制备肉桂酸。利用本专利技术可以通 过基因工程技术提高天然药效成分紫丁香苷的含量，还可以通过基因评价雪莲细胞药效成 分紫丁香苷的含量。【附图说明】 图1为紫丁香甙含量和苯丙氨酸解氨酶基因表达水平的相关性分析结果； 图2为SiPAL结构功能域预测分析（来源于NCBI数据库）； 图3为SiPAL系统进化树； 图4为表达本专利技术SiPAL基因的重组表达载体pET-SiPAL的图谱； 图5为本专利技术含SiPAL克隆的pET质粒经限制性内切酶酶切电泳鉴定结果，其中 泳道1为Ikb DNA ladder，泳道2为XhoI酶切pET-SiPAL产物，泳道3为NdeI和XhoI酶 切 pET-SiPAL 产物。 图6为SiPAL蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。其中泳道ISProtein Ruler Marker 1，泳道2为含有pET-31b(+)空载体的E. coli BL21(DE3)培养物；泳道3为 含有 pET-SiPAL 的 E. coli BL21 (DE3)培养物。【具体实施方式】 以下的实施例便于更好的理解本专利技术，但并不限定本专利技术。另外，下述实施例中， 本专利技术使用的试验方法中，如无特殊说明，均为本领域技术人员的公知常识，各种缓冲溶 液，检测试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得或者由常规实验方法制备获得。 试验中使用试剂如T4-DNA连接酶、Marker、大肠杆菌感受态DH5a和E. coli BL21 (DE3)、pET-31b (+)载体以及DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司， ExTaq酶及RNA反转录试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司公司，NdeI、Xh〇I等限制 性内切酶购自纽英伦（NEB)生物技术北京有限公司，其他常用试剂购自宝生物（大连）工 程有限公司（TaKaRa)公司。引物合成和测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。 下面通过实例进一步详细描述本专利技术。 实施例1雪莲细胞转录组测序 利用Trizol分别提取天山雪莲细胞的总RNA，通过Illumina Hiseq2000平台测 序，总计产出14372403000nt数据。组装结果总Unigenel48718个，总长138529450nt，平均 长度 931nt，N50 达到 1515nt。Unigene 功能注释，注释到 NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，C0G， GO 库的 Unigene 分别是 77514 个，63458 个，49750 个，45573 个，28939 个，55950 个，所有注 释上的Unigene是83169个。预测编码蛋白框（⑶S)，比对到蛋白库的⑶S有75735个，预 测出的CDS有5305个，共81040个。通过GO注释，Blast对比分析以及MEGA6. 0构建系统 发育树等软件分析，从中获得天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因家族序列。 所述的天山雪莲细胞是按照申请号为200510115902. 0的专利技术专利中记载的方法 获得，是选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种，给与一本文档来自技高网...
【技术保护点】
天山雪莲(Saussurea involucrata)细胞的SiPAL基因，其特征在于，该基因cDNA的长度为2405bp，开放读码框位于120‑2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，陈晓霞，杨健，查良平，刘汉石，
申请(专利权)人：大连普瑞康生物技术有限公司中国，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。