一种基于双重信号扩增的探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于双重信号扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹。本发明专利技术的探针检测成本低、检测简单快捷，具有高灵敏度、低背景噪声，以及良好的特异性。可适用于多种DNA分子的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双重信号扩增的探针及其应用
本专利技术属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于双重信号扩增的探针及其检测DNA分子的方法。
技术介绍
DNA检测(也称为基因检测)在由病毒引起的传染病的诊断、监测和治疗方面是非常重要的，例如肝炎病毒、疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒以及与基因突变相关联的其他疾病。以HIV为例，传统的确定HIV感染的方法是血液检测，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫测定(EIA)和韦斯顿吸墨试验。这些检测方法虽然很灵敏，但需要很长的时间来产生抗体，因此相当的耗时。有别于血液检测，DNA检测是直接检测病毒本身而不需要HIV抗体的，因此，一旦病人感染上HIV病毒就可以被实时检测出来。目前，在DNA检测中，聚合酶链反应(PCR)依然是一个金标准，但是，聚合酶链反应需要蛋白酶和热循环来触发扩增，因此，具有高成本、耗时长、选择性低、受限于耐热酶和实验室设备等缺点。脱氧核酶(DNA酶)属于催化核酸的一类物质，通过体外选择被分离出来，具有对特定底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性、将DNA功能和结构信息编入模板序列的灵活性，以及属于核酸低的非特异结合性等优点，是生物应用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-氯血红素DNA酶的发现引起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子--氯化血红素，形成仿过氧化物酶DNA酶，进而将H2O2介导的2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS2-)催化氧化成绿色的ABTS·-，或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-氯血红素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。例如，中国专利文献CN102827836A公开了一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子进行检测的方法，上述探针为基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA一对发夹序列，实质是杂交链式反应的发夹序列与G-四链体序列相结合的产物。当反应体系中不存在靶分子时，两个发夹序列保持亚稳态的发夹结构；当反应体系中存在靶分子时，靶分子便可与第一个发夹序列特异性结合，破坏其二级结构并释放剩余的G-四链体序列，第一个发夹释放的自由的G-四链体序列可与第二个发夹序列杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有相同作用的核酸序列，也可与第一个发夹的靶分子特异性识别部分特异性结合，从而导致两个发夹级联杂交，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，被释放的大量自由的G-四链体序列即可与氯化血红素(hemin)结合，催化氧化H2O2介导的ABTS，从而检测靶分子。但是上述探针检测靶分子时，存在背景噪声较大、灵敏度较差的问题。具体而言，在反应体系中，发夹结构与未形成发夹结构的直链是保持动态平衡的，直链未形成闭合的环而被保护，导致G-四链体序列并不全是靶分子打开第一个发夹而释放、进而与第二个发夹杂交形成的，也有部分是直链的序列与第二个发夹直接杂交，从而形成自由的G-四链体序列的，因此无法实现较为灵敏的检测。鉴于此，目前亟待提出一种操作简单、成本低同时具有高灵敏度的检测DNA的探针。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是现有技术中的DNA分子检测探针的高成本、耗时长、选择性低、受限于检测条件的问题，进而提供一种检测成本低、检测简单快捷的DNA分子检测探针。本专利技术所要解决的第二个技术问题是现有技术中基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针灵敏度低、背景噪声大，进而提供一种高灵敏度、低背景噪声的基于双重信号扩增的探针。本专利技术的基于双重信号扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹、第四发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区。所述第一发夹包括：可特异性识别目标DNA的识别区、使所述第一发夹与第二发夹形成双链体的第一碱基互补区；所述第二发夹包括：与所述第一发夹的所述识别区部分杂交的第二碱基互补区、与所述第一发夹的所述第一碱基互补区部分杂交的第三碱基互补区，以及与所述第三发夹部分杂交的第四碱基互补区；所述第三发夹包括：与所述第二发夹的所述第四碱基互补区部分杂交的第五碱基互补区、与所述第四发夹部分杂交的第六碱基互补区，以及第一G-四链体序列区；所述第四发夹包括：与所述第三发夹的所述第五碱基互补区部分杂交的第七碱基互补区、与所述第三发夹的所述第六碱基互补区部分杂交的第八碱基互补区，以及第二G-四链体序列区。发夹结构是指，DNA单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而形成的结构。本专利技术中，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹的环状区是指，在发夹结构中，未形成双链结构的、回折的部分。所述茎干区是指，形成双链结构的部分。进一步地，所述第一G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区以及G-四链体序列的1/4段序列区组成；所述第二G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区以及G-四链体序列的1/4段序列区组成。进一步地，所述第三发夹的一端部为所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区、并依次连接有所述第六碱基互补区、第五碱基互补区、以及设置在另一端的所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列；所述第四发夹的一端部为所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区、并依次连接有第七碱基互补区、第八碱基互补区、以及设置在另一端的所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列。所述第三发夹的第一G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区具有如SEQIDNo.1所示的序列结构，序列SEQIDNo.1为：5’-AGGGCGGGTGGGT-3’；G-四链体序列的1/4段序列区具有如SEQIDNo.2所示的序列结构，序列SEQIDNo.2为：5’-TGGGT-3’；所述第四发夹的第二G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区具有如SEQIDNo.3所示的序列结构，序列SEQIDNo.3为：5’-TGGGT-3’；G-四链体序列的1/4段序列区具有如SEQIDNo.4所示的序列结构，序列SEQIDNo.4为：5’-TGGGTAGGGCGGG-3’。所述第三发夹的G-四链体序列的3/4段序列区位于发夹结构的茎干区，并与所述第五碱基互补区部分杂交；所述第四发夹的G-四链体序列的3/4段序列区位于发夹结构的茎干区，并与所述第八碱基互补区部分杂交。所述第一发夹具有如SEQIDNo.5所示的序列结构，序列SEQIDNo.5为：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGAAGAAGGTGTACTGCTAGAGATTT-3’；所述第二发夹具有如SEQIDNo.6所示的序列结构，序列SEQIDNo.6为：5’-TAGCAGTACACCTTCTTCTACTGCTAGAGATTTAGAAGAAGGTGTTTAAGTA-3’；所述第三发夹具有如SEQIDNo.7所示的序列结构，序列SEQIDNo.7为：5’-AGGGCGGGTGGGTGTTTAAGTTGGAGAATTGTACTTAAACACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于双重信号扩增的探针，其特征在于，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹、第四发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区。

【技术特征摘要】
1.一种基于双重信号扩增的探针，其特征在于，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹、第四发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；所述第一发夹包括：可特异性识别目标DNA的识别区(Ⅰ)、使所述第一发夹与第二发夹形成双链体的第一碱基互补区(Ⅱ)；所述第二发夹包括：与所述第一发夹的所述识别区(Ⅰ)部分杂交的第二碱基互补区(Ⅰ’)、与所述第一发夹的所述第一碱基互补区(Ⅱ)部分杂交的第三碱基互补区(Ⅱ’)，以及与所述第三发夹部分杂交的第四碱基互补区(Ⅲ)；所述第三发夹包括：与所述第二发夹的所述第四碱基互补区(Ⅲ)部分杂交的第五碱基互补区(Ⅲ’)、与所述第四发夹部分杂交的第六碱基互补区(Ⅳ)，以及第一G-四链体序列区；所述第四发夹包括：与所述第三发夹的所述第五碱基互补区(Ⅲ’)部分杂交的第七碱基互补区(Ⅲ”)、与所述第三发夹的所述第六碱基互补区(Ⅳ)部分杂交的第八碱基互补区(Ⅳ’)，以及第二G-四链体序列区；所述第一G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ)以及G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ)组成；所述第二G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ’)以及G-四链体序列的1/4段序列区(Ⅵ’)组成；所述第三发夹的一端部为所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ)、并依次连接有所述第六碱基互补区(Ⅳ)、第五碱基互补区(Ⅲ’)、以及设置在另一端的所述第一G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列(Ⅵ)；所述第四发夹的一端部为所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4段序列区(Ⅴ’)、并依次连接有第七碱基互补区(Ⅲ”)、第八碱基互补...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹霈，吴昊，诸飞帆，刘娅灵，王洪勇，吴军，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32