一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，该方法以乙腈、四氢呋喃作为萃取剂，采用超声波快速萃取法进行萃取，再速离心取上清，这样极大的提高了萃取效率，降低了样品的基质效应，适用性强；再将上清用赭曲霉毒素A免疫亲和柱进行净化，最后定容并过0.22μm有机相滤膜，得到上机待测液，这样操作简单，净化效果好；本方法适用于多种蔬果中赭曲霉毒素A的测定，该色谱技术花费低，分离效果及色谱重现性好，可用于复杂基体中痕量组的赭曲霉毒素A定量快速测定。

【技术实现步骤摘要】
一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法
本专利技术属于痕量分析
，具体是一种检测、分析蔬果中赭曲霉毒素A的方法。
技术介绍
赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属等产毒菌株参数的一组结构类似的有毒代谢产物，广泛存在于各种食品、饲料及农产品中。赭曲霉毒素包括7种有类似化学结构的化合物，其中赭曲霉毒素A在自然界中分布最广泛，毒性最强，对人类和动植物影响最大。毒理学研究表明，赭曲霉毒素A具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、以及致畸和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。因此世界各国均重视对赭曲霉毒素A的检测和控制，制定了相关限量标准，以便于确保食品安全和消除国际贸易中的技术壁垒。目前常用的赭曲霉毒素A检测方法有薄层色谱法、气相色谱法、毛细管电泳技术（CE）、酶联免疫吸附法(ELISA)等。这些常用的检测方法对赭曲霉毒素A的检测起着非常重要的作用，但是这些方法或多或少存在一些缺陷如：样品前处理复杂、适用性差不强、灵敏度低、重现性差等问题，而且随着科学技术的发展以及检测水平的提高，对食品中的赭曲霉毒素A限量标准的要求也在不断地提高，传统的检测方法已不能满足现在的检测需求。因此建立一种快速、高通量、高灵敏度、成本低、特异性好的检测方法，从而对农产品中存在的真菌毒素进行有效监控十分必要。
技术实现思路
为了解决现有检测蔬果中赭曲霉毒素A存在的样品前处理效果差、适用性差不强、灵敏度低、重现性差等问题，提供了一种以乙腈和四氢呋喃混合液作为萃取剂，结合液相色谱仪荧光检测器进行赭曲霉毒素A检测的方法。本专利技术的目的在于提供一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，包括以下步骤：1）样品前处理：取蔬果样品碾碎，加入萃取剂，混匀，采用超声波快速萃取30～60min，萃取温度为30～40℃，离心，取上清，将上清过赭曲霉毒素A免疫亲和柱纯化，依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过滤，取滤液得到待测样品溶液；所述萃取剂为乙腈和四氢呋喃的混合液；2）建立赭曲霉毒素A标准曲线；3）用液相色谱仪荧光检测器检测样品溶液，通过标准曲线和回归方程计算得到待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度，进而计算得出样品中赭曲霉毒素A的含量。进一步的，上述步骤1）中萃取剂的用量为使蔬果样品浓度为0.4～0.6g/ml。进一步的，上述萃取剂为乙腈和四氢呋喃按体积比（0.8～1.2）：（0.8～1.2）混合的混合液。进一步的，上述萃取剂为乙腈和四氢呋喃按体积比1：1混合的混合液。进一步的，步骤1）中所述离心为1800～2200r/min离心8～12min。进一步的，步骤1）中所述真菌毒素清洗缓冲液中含有25g/L氯化钠、5g/L碳酸氢钠、0.01%v/v吐温20，余量为水。进一步的，步骤1）中所述免疫亲和柱纯化时的流速为1滴/s。进一步的，步骤1）中所述淋洗时的流速为1滴/s。进一步的，步骤1）中所述过滤的具体操作为：将洗脱液经0.22μm有机相滤膜过滤。进一步的，上述液相色谱仪荧光检测器检测为高效液相色谱仪荧光检测器检测，检测时的条件如下：a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；c)柱流速：0.9mL/min；d)柱温：35℃；e)进样量：10μL；f)检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。本专利技术的有益效果是：本专利技术的检测方法前处理过程采用乙腈、四氢呋喃萃取，再以超声波、离心进行提取的方式，极大的提高了萃取效率，降低了样品的基质效应，而且适用性强，适用于多种蔬菜中赭曲霉毒素A的测定。用赭曲霉毒素A免疫亲和柱进行净化，操作简单，净化效果好；同时用基质混合标准溶液对方法的回收率和检出限进行评价，证明方法的检出限低，可达0.0377μg/kg，重现性好，准确度高；本申请的方法适用于多种蔬菜中赭曲霉毒素A的测定，该色谱技术花费低，分离效果及色谱重现性好，可用于复杂基体中痕量组的赭曲霉毒素A定量快速测定，结果更加准确，更有利于目前市场的发展与推广。附图说明图1是赭曲霉毒素A浓度为100ng/mL的标准溶液色谱图；图2是赭曲霉毒素A色谱图；图3是赭曲霉毒素A标准曲线图。具体实施方式下面将结合具体实施方式对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1萃取剂的优化在对萃取剂进行优化之前，本实施例对是赭曲霉毒素A浓度为100ng/mL的标准溶液进行了色谱检测，色谱检测图如图1所示；以及赭曲霉毒素A的色谱图如图2所示，所得色谱曲线图作为后续赭曲霉毒素A检测实验中的阳性对照。为了得到更优提取效率的溶剂比例，对萃取剂中各成分间的配比进行优化，本专利技术方法选用的萃取剂为乙腈和四氢呋喃的混合液，分别设置乙腈和四氢呋喃体积比例为1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1作为萃取剂，对同一蔬菜样品中赭曲霉毒素A进行萃取、检测，每组重复5次，具体操作如下所述。称取已知赭曲霉毒素A浓度的10.0000g左右蔬菜样品若干份，分别加入乙腈和四氢呋喃体积比1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1的混合液作为萃取剂，定容后经超声波及离心提取。取10ml上层清液，过赭曲霉毒素A免疫亲和柱净化，依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱。然后用1ml甲醇洗脱，收集洗脱液，定容到2ml后，经0.22μm有机相滤膜过滤，得到待测样品溶液。将待测样品溶液在上述高效液相色谱仪条件下进行检测，对赭曲霉毒素A测定结果，计算其回收率，看哪组提取溶剂回收率最高，具体如表1所示：表1不同组分配比的萃取剂对检测蔬果中赭曲霉毒素A的影响从表1可看出乙腈：四氢呋喃体积比1:4提取回收率最差，体积比1:3次之，体积比1:2、2:1及3:1回收率相当，最好的是体积比1:1，五批中回收率都达到了90%以上。实施例2赭曲霉毒素A标准曲线的绘制取购买的浓度为100ng/mL的赭曲霉毒素A标准物质溶液，用色谱级甲醇和乙腈（二者体积比为1:1）稀释，配制成浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的系列标准溶液。按下述液相色谱条件进样测试：a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；c)柱流速：0.9mL/min；d)柱温：35℃；e)进样量：10μL；f)检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。计算得出赭曲霉毒素A的标准曲线和回归方程，如图3所示。实施例3一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法1）样品前处理：a.碾磨萃取：所有蔬菜样品均从市场上购买，称取10g蔬菜样品（黄瓜），将样品碾碎均质，加入萃取剂使蔬菜样品浓度为0.5g/mL，其中萃取剂为乙腈和四氢呋喃按体积比1：1混合的混合液；然后超声波处理30min，温度为40℃，2000r/min离心10min，取10ml上层清液；b.纯化：将上述上清液过赭曲霉毒素A免疫亲和柱净化，流速为1滴/s；依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，淋洗时的流速约为1滴/s；然后用1ml甲醇洗脱，收集洗脱液，定容到2ml后，经0.22μm有机相滤膜过滤，得到待测样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）样品前处理：取蔬果样品碾碎，加入萃取剂，混匀，采用超声波快速萃取30～60min，萃取温度为30～40℃，离心，取上清，将上清过赭曲霉毒素A免疫亲和柱纯化，依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过滤，取滤液得到待测样品溶液；所述萃取剂为乙腈和四氢呋喃的混合液；2）建立赭曲霉毒素A标准曲线；3）用液相色谱仪荧光检测器检测样品溶液，通过标准曲线和回归方程计算得到待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度，进而计算得出样品中赭曲霉毒素A的含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）样品前处理：取蔬果样品碾碎，加入萃取剂，混匀，采用超声波快速萃取30～60min，萃取温度为30～40℃，离心，取上清，将上清过赭曲霉毒素A免疫亲和柱纯化，依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过滤，取滤液得到待测样品溶液；所述萃取剂为乙腈和四氢呋喃的混合液，其中乙腈和四氢呋喃的体积比为1：1；2）建立赭曲霉毒素A标准曲线；3）用液相色谱仪荧光检测器检测样品溶液，通过标准曲线和回归方程计算得到待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度，进而计算得出样品中赭曲霉毒素A的含量；所述液相色谱仪荧光检测器检测为高效液相色谱仪荧光检测器检测，检测时的条件如下：a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓东，岳瑞江，何婷，邱自兵，
申请(专利权)人：深圳市宇驰检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44