一种河豚毒素的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的方法，包括以下步骤：(1)标准贮备液的配制；(2)样品的前处理；(3)液相色谱测试。本发明专利技术采用高效液相色谱法检测中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素，以便证明鲎体内的毒素到底是不是含有河豚毒素，从而知道是食什么鲎引起食鲎中毒以及含量多少，为食鲎中毒的预防和治疗提供参考。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法。
技术介绍
中国鲎主要分布于日本的濑户内海和九州岛北岸，越南、西菲律宾的岛屿，苏门达腊和爪哇岛，马来西亚的北婆罗洲以及加里曼丹东岸等海域，在中国主要分布于长江以南的浙江、福建、广东、广西、海南以及台湾等沿海海域，现以福建、广东、广西、海南为多。圆尾鲎分布于中国香港、北部湾、雷州湾、印度尼西亚爪哇岛北岸以北、菲律宾南部以西和恒河河口印度东北部以东的海域。在我国圆尾鲎主要分布于北部湾、雷州半岛西海岸以及海南的西海岸，近年来发现雷州半岛南海岸及以东沿岸均有圆尾鲎的分布，如湛江、香港等地不少海滩也分布有不少的圆尾鲎。我国人民素有吃鲎的习惯，鲎肉似蟹，只是口感较粗。在中国的广东、广西常有食鲎中毒的事件发生。河豚毒素(tet1dotoxin，TTX)是一种毒性很强的神经性毒素，它最早从河豚鱼中分离出来的。近年来还发现河豚毒素不仅存在于河豚属的鱼类，还存在于虾虎鱼、章鱼、海星、蟹类以及腹足类，甚至还有鲎等众多的海洋生物中。它们不仅本身有较强的毒性而且可以通过食物链富集等途径，污染其他水产品，给人们食用这些水产品构成极大潜在危险。在东南亚河豚毒素中毒已经成为一个难题，一般都是因为摄取了河豚鱼导致的中毒。因为在日本河豚鱼被作为一道佳肴，所以大多数的河豚中毒事件都是发生在日本。另外，误食不明鱼种也是此类中毒事件发生的重要原因，因而加强对水产品中河豚毒素的监测显得尤为必要，多省地方渔业局已将水产品中河豚毒素作为常规检测项目。河豚毒素的检测方法种类繁多，有生物测定法、理化检测方法、免疫化学测定方法等几大类。小鼠法是最常用和最简便的方法，廖永岩等也在2000年用小白鼠法检测了中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素，但此法具有定量不准确且重复性差等缺点。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种检测中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的方法。其技术方案如下:一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法，包括以下步骤:(I)标准贮备液的配制精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中，用Iml移液枪吸取1.0mL的浓度为0.2%醋酸，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液，置于冰箱中保存；(2)样品的前处理取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g，剪碎后加1ml pH = 3.5浓度为0.1 %的醋酸于玻璃匀浆器中匀浆，充分匀浆后将样品置于烧瓶中，加50ml浓度为0.1 %的醋酸，然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min，冷却后用0.45 ym滤膜真空抽滤，将滤液放入蒸发皿中，在60-70°C的水浴锅上进行蒸发浓缩，直至10ml，然后过滤定溶至10ml，将浓缩的滤液10ml放在离心管中，经10000r/min的速度，离心15分钟，取上清液经0.22 ym的微孔滤膜过滤后，放入干净的离心管中，作为液相色谱待测液；(3)液相色谱测试醋酸流动相色谱条件固定相:SunFire?C18色谱柱，直径4.6mmX长度150mm，进样量为20 y ;流动相:0.2%醋酸；流速:0.8mL/min ;紫外检测波长:210nm ;柱温:25°C ;每次进样体积为60 y L ;pH为3.0 ;磷酸流动相色谱条件固定相:SunFire?C18色谱柱，尺寸为4.6_X 150_，进样量为 20 y 1 ;流动相:0.05mol/L NaH2P04_0.05mol/L Na2HP04，pH = 6.8，庚烷磺酸钠离子对5mM ;流速:lmL/min ;紫外检测波长为200nm ;柱温:25°C;每次进样体积为60 y L ;pH为6.8。与现有技术相比，本专利技术的有益效果:1、本专利技术采用高效液相色谱法检测中国鲎和圆尾鲎体内的的河豚毒素，以便证明鲎体内的毒素到底是不是含有河豚毒素，从而知道是食什么鲎引起食鲎中毒以及含量多少，为食鲎中毒的预防和治疗提供参考。2、本专利技术样品前处理步骤中，水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min，在这一范围内，物料粘度不会随着搅拌的进行而增大，如果转速过高，粘度增大后转速会逐渐降低会影响河豚毒素的溶出。【附图说明】图1是0.2%的醋酸(pH = 3.0)做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。图2 是 0.05mol/LNaH2P04-0.05mol/L Na2HP04 (pH = 6.8)以及庚烷磺酸钠离子对5mM做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。图3是磷酸做流动相的河豚毒素标准样液相色谱图。图4是0.2 %的醋酸(pH = 3.0)做流动相的溶解物液相色谱图。图5是以磷酸缓冲液为流动相作为标准液，全波段扫描的紫外光谱图。图6是以0.2%的醋酸溶液溶解为流动相作为标准液，全波段扫描的紫外光谱图。图7是以0.2%醋酸溶解的河豚毒素标准样，全波段扫描的紫外光谱图。图8是以中国鲎的肌肉样品溶液为代表，对抽提的样品进行全波段扫描的紫外光谱图。图9是以圆尾鲎的肌肉样品溶液为代表，对抽提的样品进行全波段扫描的紫外光谱图。图10是对标准品分别选用194、198、200、204、214nm等5种波长进行色谱检测。图11是以磷酸流动相、200nm紫外波长条件下，进行0.2%醋酸和河豚毒素标准样的色谱检测。图12是将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图进行比较。图13是将河豚毒素标准样、中国鲎黄色结缔组织、圆尾鲎黄色结缔组织色谱图进行比较。图14将河豚毒素标准样、中国鲎肌肉、圆尾鲎肌肉色谱图色谱峰的高矮进行比较.图15将河豚毒素标准样、中国鲎黄色结缔组织、圆尾鲎黄色结缔组织色谱图进行色谱峰高矮的比较。【具体实施方式】:下面以实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不局限于这些实施例。材料与方法中国鲎的成鲎购于湛江海鲜批发市场；圆尾鲎成鲎采自湛江东海岛民安海区。仪器日本岛津EL-120HA电子天平(感量0.0lg)，日本岛津AY120电子天平(感量0.0OOlg)，天津市津腾实验设备有限公司GM-0.33 II真空隔膜抽滤机，科大创新股份有限公司KDC-160H高度冷冻离心机。日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津STO-20A可见-紫外检测器，SunFire?C18色谱柱(4.6mmX 150mm)，意大利哈纳HI8424 pH计，北京普析通用仪器有限公司TU1901紫外-可见分光光度计。试剂河豚毒素，经北京毕特博生物有限公司，从美国ENZO公司进口，纯度大于99%。庚烷磺酸钠，冰醋酸、NaH2POjP Na 2ΗΡ04均为分析纯，甲醇为色谱纯，购自湛江林达公司。超纯水自制。方法标准贮备液的配制精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中，用Iml移液枪吸取1.0mL的醋酸(0.2% )，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液，置于冰箱中保存。样品的前处理参照周昕等的方法进行改良的河豚毒素抽提法进行样品处理:取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g，剪碎后加1ml 0.1%的醋酸(pH = 3.5)于玻璃匀浆器中匀浆。充分匀浆后将样品置于烧瓶中，加50ml醋酸(0.1%)，然后在水浴锅中沸水浴10-20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150-200r/min。冷却后用0.45 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中国鲎和圆尾鲎体内的河豚毒素的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)标准贮备液的配制精密称量TTX 1.0mg置于5ml离心管中，用1ml移液枪吸取1.0mL的浓度为0.2％醋酸，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX贮备溶液，置于冰箱中保存；(2)样品的前处理取中国鲎或圆尾鲎待测组织10g，剪碎后加10ml pH＝3.5浓度为0.1％的醋酸于玻璃匀浆器中匀浆，充分匀浆后将样品置于烧瓶中，加50ml浓度为0.1％的醋酸，然后在水浴锅中沸水浴10‑20分钟，边加热边搅拌，转速控制在150‑200r/min，冷却后用0.45μm滤膜真空抽滤，将滤液放入蒸发皿中，在60‑70℃的水浴锅上进行蒸发浓缩，直至10ml，然后过滤定溶至10ml，将浓缩的滤液10ml放在离心管中，经10000r/min的速度，离心15分钟，取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤后，放入干净的离心管中，作为液相色谱待测液；(3)液相色谱测试醋酸流动相色谱条件固定相：SunFireTMC18色谱柱，直径4.6mm×长度150mm，进样量为20μ；流动相：0.2％醋酸；流速：0.8mL/min；紫外检测波长：210nm；柱温：25℃；每次进样体积为60μL；pH为3.0；磷酸流动相色谱条件固定相：SunFireTMC18色谱柱，尺寸为4.6mm×150mm，进样量为20μl；流动相：0.05mol/L NaH2PO4‑0.05mol/L Na2HPO4，pH＝6.8，庚烷磺酸钠离子对5mM；流速：1mL/min；紫外检测波长为200nm；柱温：25℃；每次进样体积为60μL；pH为6.8。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖永岩，
申请(专利权)人：钦州学院，
类型：发明
国别省市：广西;45