本发明专利技术涉及植物病理学和微生物基因工程领域，具体涉及棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8的应用。本发明专利技术通过基因敲除和基因互补试验，明确了基因CYC8在棉花黄萎病菌致病性、分生孢子产生、微菌核产生、黑色素积累和纤维素酶活性方面行使着重要功能。本发明专利技术所提供的基因和蛋白质的表达和修饰可作为靶位点用于设计和筛选抗真菌药剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病理学和微生物基因工程领域，具体涉及棉花黄萎病菌致病相关 基因 CYC8的应用。
技术介绍
棉花是关系到我国国计民生的重要经济作物之一，在国民经济发展中起到举足轻 重的地位，被誉为棉花的"癌症"病害一一黄萎病，是全生育期的系统性、土传维管束病害， 可在整个生育期侵染危害，导致棉花大幅减产，经济损失惨重。我国主要病原菌是大丽轮枝 菌（Verticillium dahliae Kleb)，属半知菌亚门，丛梗孢目，淡色孢科，轮枝菌属。其中，病 原菌的致病机理不清，抗病育种滞后，品种抗性丧失快，缺乏环境友好且防治效果好的杀菌 剂，是该病防治难度大，爆发成灾的主要原因。为了较好的控制一种植物病害，明确病原菌 的侵染过程和致病机理是必要的基础性工作。 目前，棉花黄萎病侵染棉花的过程是比较清楚的，土壤中微菌核或分生孢子受棉 花根系分泌物的刺激，开始萌发，产生的菌丝在寄主根表面定殖、穿过表皮、在皮层中发生 及在棉花体内扩展，最终导致症状的形成。与其它病害相比，土传病害的病原真菌尤其是棉 花黄萎病菌分子致病机理的研宄明显滞后，因此分离鉴定致病相关基因并进行功能验证显 得迫在眉睫。由于大丽轮枝菌的休眠体微菌核和分生孢子是主要的接种体，因此分离得到 同时调控微菌核和分生孢子产生的致病相关基因，并进行全面的功能分析，为揭示其分子 致病机理提供理论依据，也为棉花定向抗病育种提供可靠的靶位点，对有效防治棉花黄萎 菌病菌具有重要意义。 细胞壁作为植物的第一道物理屏障，在防御病原菌方面起重要作用。大丽轮枝菌 在侵染寄主植物时产生各种细胞壁降解酶，如果胶酶、纤维素酶等，这些细胞壁降解酶能降 解寄主植物的细胞壁，打破寄主的物理屏障，有利于病原菌的定殖、传播和症状的扩展。研 宄表明，大丽轮枝菌菌株产生纤维素酶能力与侵染力呈显著正相关，细胞壁降解酶在大丽 轮枝菌致病中作为毒力因子而起作用。应用生物信息学方法分析大丽轮枝菌VdLs. 17基因 组序列发现，含有大量的编码碳水化合物活性酶类（Carbohydrate-activeen-zymes)如果 胶酶、纤维素酶等，这可能是大丽轮枝菌能够在广泛的寄主植物上定殖的重要原因之一。目 前，已经有少数大丽轮枝菌的致病基因的功能已经得到了分析验证。 在真核生物中，复杂的生长发育过程对环境变化的响应，常常依赖于基因表达的 精细调控。一般来说，大部分基因的表达变化都是受转录水平或抑制或促进的调控。也 就是转录因子结合在特异识别的DNA位点，使该基因不能表达为负调控；从靶基因上去 除阻遏蛋白，RNA聚合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达为正调控（Berk et al. , 1999) 〇 CYC8(也叫做Ssn6)是由Trumbly (1988)首次克隆得到的，该基因全长为3. 5kb， 编码966个氨基酸，蛋白分子量是107215D，在N端和C端分别有16个和31个谷氨酸串联结 构域，是一类葡萄糖阻遏蛋白。CYC8和Tupl蛋白共同组成CYC8-Tupl抑制子，是真菌中最 为重要的一类阻遏蛋白复合物，在转录水平行使着功能。作为重要的转录调控因子，虽然 存在保守结构域，但是在不同真菌中起到的作用各有不同。在Saccharomyces cerevisiae 中，3%的功能基因表达都受到CYC8-Tupl的不同程度的调控。缺失CYC8的突变体会表现为 低生长速率、低产孢量、无法从培养基中利用胸（腺嘧啶脱氧核）苷、葡萄糖抑制作用的丧 失和对胁迫环境的应答缺陷（Smith et al·，2000)。在 Aspergillus niger 中，Tupl_Cyc8 控制细胞壁合成、发育并且影响氮源利用能力（Schachtschabe et al.，2013)。但是，CYC8 对植物病原真菌致病力的影响却未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供了一个来源于棉花黄萎病菌的、在致病性、分生 孢子产生、黑色素积累、微菌核产生和纤维素酶活性中起重要作用的基因 CYC8,通过鉴定该 基因可为防治棉花黄萎病害提供药物靶标。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供的棉花黄萎病菌的致病相关基因 CYC8(Glucose repression mediator protein CYC8)来自大_轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb)，该基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:1。 本专利技术同时提供了上述基因 CYC8的编码区序列，具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸 序列。 本专利技术同时提供了上述基因 CYC8编码的蛋白质序列，该蛋白质序列具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。 本专利技术的通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突变体库，获 得了致病力减弱的突变菌株T286。Southern杂交证实该突变菌株为T-DNA单插入突变体。 借助TAIL-PCR技术和VdLs. 17的基因组数据库，获得了 T-DNA插入的侧翼序列，并从野生 型菌株Vd080中成功克隆得到了致病相关基因 CYC8。 本专利技术利用农杆菌介导的方法，将CYC8敲除载体转入野生型菌株Vd080,得到了 三个表型稳定的基因缺失突变体Δ CYC8-45、Δ CYC8-55和Δ CYC8-56 ;将CYC8互补载体导 入转化子T286,获得三个回补突变体ACYC8-C26、ACYC8-C30和ACYC8-C36。 本专利技术测定了三个敲除突变体和三个回补突变体的生物学性状、胞外酶活性以及 对棉花的致病性，并与野生型VdOSO和转化子T286进行比较分析。结果表明：敲除突变体 ACYC8较野生型VdOSO相比，分生孢子的产量骤减，降低了一个数量级；且不产生微菌核； 纤维素酶活性极显著降低，对纤维素的利用能力较野生型降低了 16. 0-24. 7% ;致病力测定 结果表明，敲除突变体ACYC8对棉花的致病力平均降低了 60. 3%。而回补突变体ACYC8-C 的上述性状得到不同程度的恢复，接近野生型。因此判断CYC8基因是棉花黄萎病菌中重要 的致病相关基因，关联分生孢子和微菌核的产生、黑色素的积累，并对纤维素酶的活性有一 定贡献。【附图说明】 图1显示源于突变体T286中CYC8的基因信息（A T-DNA插入拷贝数分析；B TAIL-PCR电泳图；C CYC8基因结构图。 图2为CYC8敲除载体构建示意图，A CYC8融合片段获得示意图；B Gateway技术 获得敲除载体PGK02-CYC8示意图。 图3显示阳性敲除突变体ACYC8的获得以及与野生型Vd080和T286培养性 状比较图示，A三步法构建敲除转化子的电泳图谱；B阳性敲除突变体的分子检测图谱；C RT-PCR检测CYC8的表达量；D培养性状比较图示。 图4显示野生型Vd080、T286和回补突变体ACYC8-C培养性状和荧光观察比较图 示，第一列PDA培养基上培养性状观察；第二列显微镜普通视图；第三列荧光照片。 图5为敲除突变体Λ CYC8在不同碳源（脱脂奶粉、淀粉、纤维素）培养基上生长 示意图； 图6为回补突变体Λ CYC8-C在不同碳源（脱脂奶粉、淀粉、纤维素）培养基上生 长示意图。 图7显示敲除突变体Λ CYC8和回补突本文档来自技高网...
【技术保护点】
棉花黄萎病菌致病相关基因CYC8用于筛选棉花抗黄萎病真菌药剂的应用，其中，基因CYC8的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李志芳，朱荷琴，冯自力，师勇强，赵丽红，冯鸿杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41
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