【技术实现步骤摘要】
坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法。
技术介绍
坏死梭杆菌是一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态杆菌，主要分布于人和动物的口腔、胃肠道和泌尿生殖道，是一种条件致病菌，常引起人的急慢性咽喉炎(Lemierre’ssyndrome)和牛、羊、鹿等反刍动物的腐蹄病和肝脓肿，多呈慢性经过，如果治疗不及时，会引起动物蹄部以及肝、肾等内脏器官出现脓肿、坏死等症状，进而影响动物的生产性能，给养殖业带来巨大经济损失。获得某个特定蛋白质的方法主要有两种，第一种是通过分离纯化的方法获得天然的蛋白质，该方法适用于已知各种理化性质(如：分子量、等电点、疏水性、配体特异性等)的蛋白质，这样可以充分利用该蛋白质的理化性质，从天然材料中分离纯化出特定的蛋白质，但是对于一些未知蛋白或者理化性质未知的蛋白质来说，该方法显然不是经济有效的。第二种是通过体外重组的方法，借助于表达载体和表达宿主，获得重组的蛋白质，该方法是根据编码特定蛋白质的核苷酸序列，设计特异性引物，通过PCR扩增的方法，得到特定蛋白质的核苷酸序列，将该基因片段连接在表达载体上，转化或者转染表达宿主，在适宜的条件下进行表达，从而获得重组的特异性蛋白质。目前已知细菌粘附宿主细胞是引起发病的首要步骤，而坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白具有粘附作用，因此初步推测血凝素相关外膜蛋白在坏死梭杆菌致病过程中起着重要的作用。目前，在GenBank中公布有坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的部分核苷酸序列，但是对坏死梭杆菌全基因组及梭菌属的其他细菌的研究较...
【技术保护点】
坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白，其特征在于，该蛋白的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示。
【技术特征摘要】
1.坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白，其特征在于，该蛋白的基因核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:7所示；该蛋白的基因核苷酸序列通过染色体步移方法克隆得到。2.制备如权利要求1所述的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：步骤一、采用染色体步移方法对坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列进行克隆和测序(1)根据公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列，设计引物：SP1：5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，SP2：5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，SP3：5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，SP4：5'-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3'，SP5：5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，SP6：5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3'；(2)以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，GenomeWalkingkit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为上游引物，SP1为第一轮PCR的下游引物，SP2为第二轮PCR的下游引物，SP3为第三轮PCR的下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH2O；PCR反应条件见表1；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coliTransT1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示；表1(3)以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，SP4为第一轮PCR的上游引物，SP5为第二轮PCR的上游引物，SP6为第三轮PCR的上游引物，GenomeWalkingkit中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4分别为下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第一轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH2O；第三轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL，包括1μL第二轮PCR扩增产物，8μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，5μL含Mg2+plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL浓度为5U/μL的LATaq，1μL浓度为100pmol/μL的上游引物，1μL浓度为10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH2O；PCR反应条件见表2；胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E.coliTransT1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接为1023bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示；表2步骤二、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的验证(1)根据步骤一的测序结果，设计引物：j1：5'-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3'，J2：5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3'；(2)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的验证以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，j1为上游引物，SP3为下游引物，采用高保真的FastPfuDNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的5'端未知序列；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL5×TransStartFastPfuBuffer，5μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，1μL高保真的FastPfuDNA聚合酶，28μLddH2O，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coliTransT1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:3所示；(3)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的验证以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，SP6为上游引物，j2为下游引物，采用高保真的FastPfuDNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的3'端未知序列，PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL5×TransStartFastPfuBuffer，5μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，1μL高保真的FastPfuDNA聚合酶，28μLddH2O，PCR反应条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，30次循环，72℃延伸10min，4℃终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E.coliTransT1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1000bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:4所示；(4)经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列与3'端未知序列的拼接与分析经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列总长度为1248bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠174个碱基，经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列总长度为1000bp，与公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列重叠272个碱基，根据重叠的核苷酸序列，将经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布号为AF529887.1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列和经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列拼接在一起，得到总长度为4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQIDNO:5所示；利用NCBI在线工具预测4247bp核苷酸序列的开放阅读框，预测结果为4247bp核苷酸序列中含有从ATG到TAA共3372bp的开放阅读框，该坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:6所示，编码的1123个氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:7所示；步骤三、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的分段克隆以及原核表达载体的构建(1)根据步骤二中获得的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列，设计三对fP1/rP1、fP2/rP2、fP3/rP3：fP1：5'-CCGGAATTCTATTCTGGTTCATTGGGTTGGATAAC-3'，rP1：5'-CCGCTCGAGTTAGAAAATAACTCTTAGCCCT-3'，fP2：5'-CCGGAATTCACAAGTACAGGTGGAAGTGCAACTTTA-3'，rP2：5'-CCGCTCGAGTTTAAACTTTTCCCGTTCCTGGAT-3'，fP3：5'-CCGGAATTCATGAATCAGGACTCAAGATTGTTCT-3'，rP3：5'-CCGCTCGAGTTTAATCACTGGAATAAATAAAGGTTGC-3'；分段扩增三个彼此部分重叠且覆盖坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3；基因片段p1的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:8所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:9所示，基因片段p2的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:10所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:11所示，基因片段p3的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:12所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:13所示；(2)以坏死梭杆菌AB型菌株的基因组DNA为模板，以fP1为上游引物，rP1为下游引物，PCR扩增基因片段p1；以fP2为上游引物，rP2为下游引物，PCR扩增基因片段p2；以fP3为上游引物，rP3为下游引物，PCR扩增基因片段p3；PCR反应体系总体积为50μL，包括2μL模板，2μL浓度为10μmol/L的上游引物，2μL浓度为10μmol/L的下游引物，10μL5×TransStartFastPfuBuffer，5μL浓度为2.5mmol/Leach的dNTPsMixture，1μL高保真的FastPfuDNA聚合酶，28μLddH2O，PCR扩增基因片段p1的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈立志，吴洪超，冯二凯，刘晓颖，彭风华，程世鹏，闫喜军，吴威，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，吉林特研生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。