抗ROBO4抗体制造技术

本发明专利技术公开内容涉及具有抗血管生成活性的抗体。更具体地，本发明专利技术公开内容涉及抗ROBO4的抗体和包含所述抗体的药物组合物。本发明专利技术公开内容的一个目的是提供具有抗血管生成效果的抗ROBO4抗体、包含所述抗体的药物组合物等、使用所述抗体抑制血管生成的方法等等。本发明专利技术公开内容的另一个目的是提供一种生产所述抗体的方法。本发明专利技术公开内容的所述抗体激活ROBO4的下游信号，并且具有针对由VEGF或bFGF诱导的细胞迁移的抑制活性。本发明专利技术公开内容的所述抗体还在体内模型中显示了抗血管生成效果。因此，所述问题已得到解决。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗ROBO4抗体本专利技术涉及具有抗血管生成活性的抗体。更具体地，本专利技术涉及抗ROBO4抗体和包含所述抗体的药物组合物。[背景领域]Roundabout同源物4(ROBO4)，分子量为110kDa的蛋白质，具有单次跨膜结构(非专利文献1)，并且已知通过结合已知的血管生成抑制剂剂Slit同源物2(Slit2)(专利文献1和非专利文献2)抑制血管生成。已报导Slit2抑制通过血管内皮生长因子(VEGF)促进的HUVEC的迁移，还已报导对于ROBO4基因转染的血管内皮细胞(在下文中，所述血管内皮细胞也称为"EC")，相较于空载体转染的EC，Slit2抑制VEGF或bFGF对细胞迁移的促进(专利文献1和非专利文献2－4)。此外，已报导在从野生型小鼠衍生的EC或利用对照siRNA转染的EC中但不是在从ROBO4基因敲除小鼠衍生的EC或利用敲低ROBO4基因的siRNA转染的EC中，观察到Slit2针对VEGF对细胞迁移的促进、管腔形成的促进或通透性的增加的抑制作用(专利文献2和非专利文献4至6)。此外，已报导Slit2通过ROBO4在具有激光诱导的脉络膜新生血管化或氧诱导性视网膜病变的小鼠模型中抑制血管生成或血管通透性的增加，所述小鼠模型为具有渗出性年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病变的动物疾病模型(专利文献2和非专利文献4)。尽管存在这些发现，但还有显示ROBO4不结合Slit2的报导(非专利文献9和专利文献5)。关于其功能还已报导ROBO4参与血管生成的促进而非血管生成的抑制，因为ROBO4基因敲除EC的迁移或管腔形成被抑制(非专利文献10和11)。在临床实践中，已报导ROBO4在来自结肠癌、神经节神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、转移性黑素瘤、肾癌、肺癌、肝癌或结肠癌的肝转移中的瘤内血管中高度表达(专利文献3和非专利文献1、3和7)。此外，已报导ROBO4也在增生性糖尿病视网膜病变患者的纤维血管膜中的血管中表达(非专利文献8)。这样，ROBO4在血管内皮细胞，具体地，在病理状态中新近形成的血管的内皮细胞中表达。这可表明因ROBO4的高度表达而引起的病理性血管生成，但也可表明用于抑制病理性血管生成的ROBO4的补偿性表达。如上所述，ROBO4参与抗血管生成作用。因此，假定抗ROBO4的抗体及其功能性片段在涉及血管生成的疾病的治疗中是有用的。然而，不能断定抗ROBO4的激动性或拮抗性(agonisticorantagonistic)抗体是抑制还是促进血管生成。EP专利号1,565,491(专利文献4)和WO2008/100805(专利文献5)中描述的抗体称为抗ROBO4的抗体(在下文中，称为"抗ROBO4抗体")。但这些抗体在体内都不显示对血管生成的阻抑或抑制作用。[引用列表][专利文献][专利文献1]WO2004/003163[专利文献2]WO2008/073441[专利文献3]WO2002/036771[专利文献4]欧洲专利号1,565,491[专利文献5]WO2008/100805[非专利文献][非专利文献1]Genomics,2002,vol.79,p.547-552[非专利文献2]DevelopmentalBiology,2003,vol.261,p.251-267[非专利文献3]BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2005,vol.332,p.533-541[非专利文献4]NatureMedicine,2008,No.14,p.448-453[非专利文献5]ScienceTranslationalMedicine,2010,vol.2,p.23ral9[非专利文献6]ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,vol.107,p.10520-10525[非专利文献7]OncologyReports,2006,vol.15,p.1437-1443[非专利文献8]MolecularVision,2009,vol.15,p.1057-1069[非专利文献9]TheFASEBJournal,2005,vol.19,p.121-123[非专利文献10]BMCCellBiology,2008,vol.9,p.61-72[非专利文献11]TheFASEBJournal,2009,vol.23,p.513-522[专利技术概述][本专利技术待解决的问题]本专利技术的一个目的是提供抗ROBO4的抗体。本专利技术的另一目的是提供包含具有抗血管生成作用等的抗ROBO4抗体的药物组合物。本专利技术的又一目的是提供用于产生所述抗体的方法。本专利技术的进一步目的是提供使用所述抗体等抑制血管生成的方法。[解决问题的方法]本专利技术人已进行勤奋的研究来实现这些目的，从而成功地构建了检测ROBO4的下游信号的激活的筛选系统。此外，本专利技术人已使用筛选系统来成功地获得新的抗ROBO4单克隆抗体，所述抗体激活ROBO4的下游信号，在表达ROBO4的EC中具有抑制由各种血管生成因子(例如VEGF、bFGF、HGF、PDGF-BB和SDF-1)诱导的细胞迁移的活性，并且甚至在体内模型中显示抗血管生成作用。这样，完成了本专利技术。具体地，本专利技术涉及：(1)具有下列(I)至(III)中描述的性质的抗体或其功能性片段：(I)结合ROBO4蛋白，优选以1×10-8或更低，特别优选的5×10-9或更低的KD值结合；(II)在体外不存在交联抗体(cross-linkingantibody)的情况下阻抑或抑制血管内皮细胞迁移；和(III)在体内阻抑或抑制血管生成；(2)根据(1)的抗体或其功能性片段，其中ROBO4蛋白为人ROBO4蛋白；(3)根据(1)的抗体或其功能性片段，其中ROBO4蛋白是由SEQIDNO：2的氨基酸No.1至1007的氨基酸序列组成的蛋白质；(4)根据(1)的抗体或其功能性片段，其中ROBO4蛋白是由SEQIDNO：2的氨基酸No.46至1007的氨基酸序列组成的蛋白质；(5)根据(3)或(4)的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合由SEQIDNO：2的氨基酸No.132至209的氨基酸序列组成的位点；(6)根据(1)的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段为单克隆抗体或其功能性片段；(7)根据(1)至(6)中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体由重链和轻链组成，所述重链包含由SEQIDNO：44(图25)所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQIDNO：46(图26)所示的氨基酸序列或通过一个氨基酸的置换从SEQIDNO：46的氨基酸序列衍生的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQIDNO：48(图27)所示的氨基酸序列组成的CDRH3，所述轻链包含由SEQIDNO：50(图28)所示的氨基酸序列或通过1至3个氨基酸的置换从SEQIDNO：50的氨基酸序列衍生的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQIDNO：52(图29)所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQIDNO：54(图30)所示的氨基酸序列组成的CDRL3；(8)根据(1)至(7)中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体由重链和轻链组成，所述重链包含由S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有下列(I)至(III)中描述的性质的抗体或其功能性片段：(I)以1x10‑8或更低的KD值结合ROBO4蛋白；(II)在体外在交联抗体不存在的情况下阻抑或抑制血管内皮细胞迁移；和(III)在体内阻抑或抑制血管生成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.27 JP 2012-103929;2013.01.24 JP 2013-011041.一种具有下列(I)至(III)中描述的性质的抗体或其功能性片段：(I)以1x10-8或更低的KD值结合ROBO4蛋白；(II)在体外在交联抗体不存在的情况下阻抑或抑制血管内皮细胞迁移；和(III)在体内阻抑或抑制血管生成；其中所述抗体由重链和轻链组成，所述重链包含由SEQIDNO：44即图25所示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQIDNO：46即图26所示的氨基酸序列或由SEQIDNO：68即图44所示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQIDNO：48即图27所示的氨基酸序列组成的CDRH3，所述轻链包含由SEQIDNO：50即图28所示的氨基酸序列或由SEQIDNO：70即图46所示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQIDNO：52即图29所示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQIDNO：54即图30所示的氨基酸序列组成的CDRL3。2.权利要求1的抗体或其功能性片段，其中所述抗体包含由SEQIDNO：31即图16所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQIDNO：33即图18所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。3.权利要求1的抗体或其功能性片段，其中所述抗体包含选自下列a)至d)的任意一个重链可变区和选自e)和f)的轻链可变区：a)由SEQIDNO：56即图32的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的hMAb1-H1-型重链可变区，b)由SEQIDNO：58即图34的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的hMAb1-H2-型重链可变区，c)由SEQIDNO：60即图36的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的hMAb1-H3-型重链可变区，和d)由SEQIDNO：62即图38的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的hMAb1-H4-型重链可变区；和e)由SEQIDNO：64即图40的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的hMAb1-L1-型轻链可变区，和f)由SEQIDNO：66即图42的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的hMAb1-L2-型轻链可变区。4.权利要求1的抗体或其功能性片段，其中所述抗体包含下列重链可变区与轻链可变区的组合1)至6)中的任一组合：1)由SEQIDNO：58即图34的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQIDNO：64即图40的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，2)由SEQIDNO：58即图34的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQIDNO：66即图42的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的轻链可变区，3)由SEQIDNO：62即图38的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQIDNO：66即图42的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；4)由SEQIDNO：62即图38的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQIDNO：64即图40的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；5)由SEQIDNO：56即图32的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQIDNO：64即图40的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；和6)由SEQIDNO：60即图36的氨基酸No.20至137所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQIDNO：64即图40的氨基酸No.21至134所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。5.权利要求1－4中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述ROBO4蛋白为人ROBO4蛋白。6.权利要求1－4中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述ROBO4蛋白是由SEQIDNO：2的氨基酸No.1至1007的氨基酸序列组成的蛋白质。7.权利要求1－4中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述ROBO4蛋白是由SEQIDNO：2的氨基酸No.46至1007的氨基酸序列组成的蛋白质。8.权利要求1－4中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段结合由SEQIDNO：2的氨基酸No.132至209的氨基酸序列组成的位点。9.权利要求1－4中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段为单克隆抗体或其功能性片段。10.权利要求1至4中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段为嵌合抗体或其功能性片段。11.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：井角能隆，佐藤俊之，长谷川淳，井上达也，
申请(专利权)人：第一三共株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP