本发明专利技术公开了一种高效生产维生素C-2磷酸酯的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过利用产维生素C磷酸化酶的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET20b--asp，在温度为37℃、当OD值达到0.4时添加6g/L的乳糖进行诱导，诱导培养4h后，收集菌体，取10.6g/L(以干重计算)菌体加入到含有200g/L维生素C和224g/L的焦磷酸钠的转化液中，在温度为43℃、pH4.3条件下转化2h后，维生素C-2磷酸酯的产量达到了82.3g/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效生产维生素C-2磷酸酯的方法，属于生物
技术介绍
维生素C-2憐酸醋(L-ascorbyl-2-phosphate，ASP)，又称L-抗坏血酸_2_憐酸或抗坏血酸磷酸酯，分子式为C6H6O9P,相对分子量为322.1，维生素C-2磷酸酯为白色或类白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，不溶于有机溶剂。维生素C磷酸酯作为维生素C多种衍生物中性能最好的一种衍生物，克服了维生素C本身存在的缺陷(如，受热易分解和易氧化)，经口服或皮肤吸收进入人体后，能通过磷酸酯酶迅速酶解游离出维生素C，发挥其特有的生理生化功能。维生素C-2磷酸酯在各个领域有着重要的应用前景，作为一种营养强化剂，广泛应用于食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中。维生素C磷酸化酶是一种酸性磷酸酶，能立体特异性作用于维生素C的(:2位上进行磷酸化，生成相应的维生素C-2磷酸醋。1993年，TastsuroFuj1等首次在Pseudomonas azotocolligansATCC12417中发现了维生素C磷酸化酶从而实现了酶法生产维生素C-2磷酸醋的可能，随后Mkihikomaruyam等对该的酶学性质做了进一步研宄确定了该酶的Km值为147mM，分子量为29，000，酶活力为6.39U/mg纯蛋白；此后对越来越多的研宄者投入到维生素C磷酸化酶的研宄中，如2004年，MinJing等详细研宄了FlavobacteriumdevoransATCC10829中的维生素C磷酸化酶，并确定了该酶的酶学性质发现该酶具有更好的催化性能，该酶Km值为6.2mM、分子量大小为29，000,9.42U/mg纯蛋白、最适温度为45°C、最适pH为4.5、pH稳定范围为4.5-7.0 ；2007年，Shinffoo-JUNG等利用Brevundimonasdiminuta菌株作为酶制剂，以维生素C和焦磷酸作为底物转化36h维生素C-2磷酸酯产量达到27.5g/L。近几年，随着国内维生素C的生产量供过于求，致使维生素C的价格持续下降，因此不少企业转向了投资维生素C的高附加值产品，其中维生素C-2磷酸酯就是典型代表。直至现在国内工业化生产维生素C-2磷酸酯主要采用的是化学合成法，然该方法存在很多问题，诸如副产物多，生产条件要求高、环境污染等一系列问题。此外国外也有企业开始利用生物酶合成法来生产维生素C-2磷酸酯，然生产强度和转化率较低等也很大程度上限制了其大型工业化生产。因此开发新的酶法生产维生素C-2磷酸酯的技术显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高生产强度，经济，环保，低能耗的手段来生产维生素C-2磷酸酯。利用此专利技术来生产维生素C-2磷酸酯具有极高的生产强度，减少了工业生产的生产周期极大提高了工业化生产的生产效率。本专利技术提供了一种高效生产维生素C-2磷酸酯的方法。所述方法是以重组菌株E.coliBL21 (DE3)/pET20b__asp的破碎后的菌体悬液作为酶制剂，在转化温度为30-50 °C、转化pH为3.8-5.5的条件下，与150_250g/L的维生素、0.2-1.0mol/L的焦磷酸钠反应，转化时间为0.5_4h ;所述重组菌株菌体的添加量为2.6-20g/L(以菌体干重计)。所述重组菌株是先进行诱导产酶培养，然后再破碎作为酶制剂。所述诱导产酶培养，在本专利技术的一种实施方式中，是指:将菌株培养至OD6c?在0.2-1.4范围内，加入2-10g/L的乳糖进行诱导，诱导温度为30-37°C，诱导时间为2_10h。所述重组菌，在本专利技术的一种实施方式中，以E.coliBL21(DE3)为宿主、pET20b_S载体，重组表达来源于SphingomonastrueperiDSM7225中的维生素C磷酸化酶基因asp。所述诱导培养，在本专利技术的一种实施方式中，具体是:将菌株培养至0D_ =0.4-0.6，加入6g/L的乳糖进行诱导，诱导温度为37°C，诱导时间为4h。在此诱导条件下，重组菌产酶能力达到了 3.2U/mL。所述E.coliBL21(DE3)/pET20b_-asp的破碎，在本专利技术的一种实施方式中，破碎的具体条件是:功率17w，总时间30min，间歇4s，超声4s。所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，具体是在转化温度为30_50°C、转化pH为3.8-4.6的条件下，与150-225g/L的维生素、0.5-0.9mol/L的焦磷酸钠反应，转化时间为1-2.5h，其中重组菌株菌体的添加量为2.6-13.2g/L。pH3.8-4.6的pH对转化生产维生素C-2磷酸酯影响较小，30-46°C的温度对转化生产维生素C-2磷酸酯影响也较小。该条件下得到的维生素C-2磷酸酯的产量在60g/L以上。所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，转化温度43°C、pH4.2、VC浓度200g/L、ppi 浓度 0.6mol/L、菌体量 10.6g/L。所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，具体是:(1)将E.coliBL21(DE3)/pET20b_-asp菌株培养至OD6c?在0.4-0.6，加入6g/L的乳糖进行诱导，诱导温度为37°C，诱导时间为4h ； (2)将上一步得到的菌体收集、破碎；(3)以上一步破碎后的菌体悬液作为酶制剂，在43°C、pH4.2下进行反应，其中VC浓度200g/L、ppi浓度0.6mol/L、菌体量10.6g/Lo得到的维生素C-2磷酸酯产量达82g/L。本专利技术还要求保护按上述方法制备得到的维生素C-2磷酸酯，以及维生素C-2磷酸酯在食品、有机合成、化妆品和饲料方面的应用。本专利技术的有益效果:按本专利技术的方法转化生产维生素C-2磷酸酯，可以在较高底物浓度下保证相对较高的转化率，维生素C-2磷酸酯产量达到86.4g/Lo利用此专利技术来生产维生素C-2磷酸酯具有极高的生产强度，减少了工业生产的生产周期极大提高了工业化生产的生产效率。【附图说明】图1:不同VC浓度对转化维生素C生产维生素C-2磷酸酯的影响；图2:不同焦磷酸钠浓度对转化维生素C生产维生素C-2磷酸酯的影响；图3:不同菌体量对转化维生素C生产维生素C-2磷酸酯的影响。【具体实施方式】维生素C磷酸化酶酶活力测定取发酵液ImL于1.5mL离心管中于8000Xg离心2min，上清备用作为胞外组分，菌体沉淀用生理盐水洗涤三次，用0.5mL的去离子水重悬沉淀，超声破碎后，破碎液作为胞内组分。取200uL的粗酶液加入到0.8ml的测定液中，测定液成分为:0.4mol/L维生素C，0.2mol/L焦磷酸钠，pH4.2。并将其置于37°C水浴30min，并用5%的三氯乙酸终止反应，然后用HPLC测定维生素C-2磷酸酯的含量(以灭活的酶液作同样操作为空白对照)。维生素C磷酸化酶酶活力单位(U)定义为:在上述条件下，每分钟产生Iumol维生素C-2磷酸酯所需酶量。实施例1:重组菌的诱导产维生素C磷酸化酶将种子液转接至含有氨苄抗生素的液体LB培养基中，与37°C、200rpm条件下培养。将菌株培养至0D_= 0.2，加入2g/L的乳糖进行诱导，诱导温度为30°C，诱导时间为2h。在此诱导条件下，重组菌产酶能力达到了 2.14U/mL。实施例2:重组菌的诱导产维生素C磷本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效生产维生素C‑2磷酸酯的方法，其特征在于，所述方法是以重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET20b‑‑asp破碎后的菌体悬液作为酶制剂，在转化温度为30‑50℃、转化pH为3.8‑5.5的条件下，与150‑250g/L的维生素、0.2‑1.0mol/L的焦磷酸钠反应，转化时间为0.5‑4h；所述重组菌株菌体，按干重计，添加量为2.6‑20g/L。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，董晓翔，刘杰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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