一种荧光生物传感器，其制备方法以及用途技术

本发明专利技术涉及一种荧光生物传感器，其制备方法以及用途，基于二维二氧化锰纳米片为荧光传感平台,使用吗啉乙磺酸还原高锰酸钾一步合成二氧化锰纳米片，二氧化锰纳米片吸附FAM‑ssDNA，猝灭FAM荧光。在碱性磷酸酶的作用下，将维生素C磷酸酯镁水解生成抗坏血酸，二维二氧化锰纳米片被抗坏血酸还原成锰离子，释放出FAM‑ssDNA并恢复荧光，构建了由二氧化锰纳米片和碱性磷酸酶调节荧光强度的荧光传感器检测碱性磷酸酶活性。与现有技术相比，本发明专利技术利用二维二氧化锰纳米片对荧光信号的改变，即“off‑on”模式检测碱性磷酸酶，具有简单、快速、背景信号低、灵敏度高、检测限低、选择性好的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物传感器
，具体涉及一种基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台的方法及其应用，可以实现对碱性磷酸酶活性的灵敏检测。
技术介绍
碱性磷酸酶(ALP)是一种磷酸单酯酶，促进各种磷酸化底物的去磷酸化过程。已经证明碱性磷酸酶在调节细胞生长、细胞凋亡等细胞内过程中起着至关重要的作用，因此常常作为各种疾病的诊断指标，包括乳腺癌和前列腺癌、骨病、肝功能异常、糖尿病。此外，碱性磷酸酶在环境和食品质量监测中也发挥着重要的作用。因此，设计一种简单，灵敏检测碱性磷酸酶活性的方法极其重要。目前基于碱性磷酸酶对不同底物的去磷酸化作用检测其活性的方法多涉及复杂和耗时冗长的检测过程。荧光光谱法由于其优越的灵敏度，操作简单，良好的重现性和低成本，受到广泛的关注。然而，大多数采用信号循环放大来提高灵敏度，忽视了降低背景信号，限制了检测灵敏度和检测范围。因此，采用降低背景信号快速灵敏检测碱性磷酸酶活性非常值得期待。近年来，二维二氧化锰纳米片由于其独特的物理和化学性质引起了研究人员的关注。二氧化锰纳米片作为氧化还原活性的过渡金属氧化物具有良好的水溶性和优良的生物相容性，由于其具有高的比表面积和良好的物理吸附能力以及荧光猝灭能力在生物传感器中具有广泛应用。因此，利用二维二氧化锰纳米降低背景信号，开发简单、高灵敏性、高选择性的荧光生物传感器检测碱性磷酸酶活性至关重要。
技术实现思路
本专利技术公开了一种基于二维二氧化锰纳米片为荧光传感平台，使用吗啉乙磺酸还原高锰酸钾一步合成二氧化锰纳米片，二氧化锰纳米片吸附FAM-ssDNA，猝灭FAM荧光。在碱性磷酸酶的作用下，将维生素C磷酸酯镁水解生成抗坏血酸，二维二氧化锰纳米片被抗坏血酸还原成锰离子，释放出FAM-ssDNA并恢复荧光，构建了由二氧化锰纳米片和碱性磷酸酶调节荧光强度的荧光传感器。本专利技术还提供了一种荧光生物传感器的应用，利用制备的荧光生物传感器，不同浓度的碱性磷酸酶荧光强度不同，构建线性关系，实现了对碱性磷酸酶灵敏性、特异性的检测。具体技术方案如下：一种荧光生物传感器的制备方法，包括如下步骤：(1)合成单层二维二氧化锰纳米片；(2)将FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中，得到FAM-DNA缓冲溶液和碱性磷酸酶溶液；(3)取FAM-DNA溶液，加入不同浓度的二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，得到第一状态的荧光生物传感器；(4)在步骤(3)中得到的混合液中，加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，反应得到第二状态的荧光生物传感器。进一步地，步骤(1)中，取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将混合液超声30分钟；步骤(4)中，在37℃的恒温箱中反应30min。进一步地，步骤(3)中，第一状态的荧光生物传感器为“关闭”的荧光生物传感器，步骤(4)中，第二状态的荧光生物传感器为“开”的荧光生物传感器。步骤(1)包括如下步骤：(1-1)高锰酸钾浓度为10mM，吗啉乙磺酸缓冲溶液为0.1M，pH＝6.0，取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中；(1-2)将混合液超声30分钟，形成棕褐色溶液；(1-3)将超声后的混合液先7000rpm离心15分钟；(1-4)用去离子水和乙醇洗涤沉淀，去除残余反应物；(1-5)将沉淀在60℃干燥；(1-6)将沉淀超声分散在50ml去离子水中，在4℃下保存备用。进一步地，步骤(2)包括如下步骤：(2-1)将10μL100μMFAM-DNA缓冲溶液加入1990μLTris–HCl缓冲溶液得到500nM溶液，4℃下保存备用；(2-2)将碱性磷酸酶用0.01M，pH值为8.12且含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液稀释得到2500U/ml，-4℃下保存备用。进一步地，步骤(3)中，取40μL步骤(2)中FAM-DNA溶液，加入40μL二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，室温下放置5min，使FAM-DNA吸附在二氧化锰纳米片上，FAM的荧光被猝灭。进一步地，步骤(4)中，加入40μL维生素C磷酸酯镁和不同体积的碱性磷酸酶，在37℃的恒温箱中反应30min，使维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶充分反应生成抗坏血酸，还原二氧化锰纳米片，释放出FAM-DNA，恢复荧光。进一步地，步骤(2)中稀释FAN-DNA的缓冲溶液Tris-HCl的pH为8.5，浓度为0.1M；步骤(3)中，FAM-DNA溶液加入二氧化锰纳米片反应不同时间，反应5minFAM荧光能达到最大程度的猝灭；和/或，步骤(3)中，FAM-DNA最终浓度为100nM，二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/mL；步骤(3)中的混合液，用荧光仪检测荧光强度；步骤(4)中，FAM-DNA最终浓度为100nM，二氧化锰纳米片浓度为0.2mg/Ml，维生素C磷酸酯镁的最终浓度为0.02M，和碱性磷酸酶的最终浓度分别为5.0U/L，10.0U/L，20.0U/L，30.0U/L，50.0U/L，100.0U/L，150.0U/L，200.0U/L，300.0U/L，400.0U/L，500.0U/L；和/或，步骤(4)中，碱性磷酸酶用0.01M，pH值为8.12含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液稀释；步骤(4)中，混合液用荧光仪检测荧光强度，构建线性关系，实现对碱性磷酸酶活性的检测。一种荧光生物传感器，采用上述制备方法制得的基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台。上述荧光生物传感器的用途，用于对不同浓度的碱性磷酸酶活性检测。与目前现有技术相比，本生物传感器的制备方法，使用的二氧化锰纳米片合成简单，耗能低，成本低，生物相容性好，首先利用二氧化锰纳米片猝灭FAM-DNA的荧光，从而降低背景信号；然后利用维生素C磷酸酯镁与碱性磷酸酶反应生成抗坏血酸还原二氧化锰，得到自由的FAM-DNA并恢复荧光，最后利用FAM-DNA荧光恢复的强度构建与碱性磷酸酶浓度的线性关系，实现对碱性磷酸酶活性的检测。因此对碱性磷酸酶活性的检测具有低背景，灵敏度高、检测限低、选择性好的特点。附图说明图1为基于二维二氧化锰纳米片--荧光探针构建的荧光传感平台检测碱性磷酸酶活性的示意图；图2A为二氧化锰纳米片的扫描电子显微镜表征图；图2B为二氧化锰纳米片的透射电子显微镜表征图；图3A为FAM-DNA的荧光激发光谱和荧光发射光谱图；a为FAM-DNA的荧光激发光谱；b为FAM-DNA荧光发射光谱；图3B为不同浓度的二氧化锰纳米片对FAM-DNA荧光强度影响的荧光光谱图；a为10OnMFAM-DNA；b为0.02mg/mlMnO2，c为0.04mg/mlMnO2，d0.08mg/mlMnO2，e0.12mg/mlMnO2，f0.16mg/mlMnO2，g0.20mg/mlMnO2，h0.3mg/mlMnO2，i0.4mg/mlMnO2，j0.5mg/mlMnO2；图3C为二氧化锰纳米片浓度与荧光强度变化的曲线图；图3D为二氧化锰纳米片浓度与荧光强度的线性关系图；图3E为该方法可行性的荧光光谱图；a为10OnMFAM-DNA；b为在a溶液中含有0.2mg/mlMnO2；c为在b溶液中含有0.2mg/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成单层二维二氧化锰纳米片；(2)将FAM‑DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中，得到FAM‑DNA缓冲溶液和碱性磷酸酶溶液；(3)取FAM‑DNA溶液，加入不同浓度的二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，得到第一状态的荧光生物传感器；(4)在步骤(3)中得到的混合液中，加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，反应得到第二状态的荧光生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成单层二维二氧化锰纳米片；(2)将FAM-DNA序列和碱性磷酸酶溶解在Tris–HCl缓冲溶液中，得到FAM-DNA缓冲溶液和碱性磷酸酶溶液；(3)取FAM-DNA溶液，加入不同浓度的二氧化锰纳米片，摇动混合均匀，得到第一状态的荧光生物传感器；(4)在步骤(3)中得到的混合液中，加入一定量的维生素C磷酸酯镁和碱性磷酸酶，反应得到第二状态的荧光生物传感器。2.如权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将混合液超声30分钟；步骤(4)中，在37℃的恒温箱中反应30min。3.如权利要求1和2所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，第一状态的荧光生物传感器为“关闭”的荧光生物传感器，步骤(4)中，第二状态的荧光生物传感器为“开”的荧光生物传感器。4.如权利要求1-3所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：(1-1)高锰酸钾浓度为10mM，吗啉乙磺酸缓冲溶液为0.1M，pH＝6.0，取5ml高锰酸钾与12ml吗啉乙磺酸缓冲溶液中；(1-2)将混合液超声30分钟，形成棕褐色溶液；(1-3)将超声后的混合液先7000rpm离心15分钟；(1-4)用去离子水和乙醇洗涤沉淀，去除残余反应物；(1-5)将沉淀在60℃干燥；(1-6)将沉淀超声分散在50ml去离子水中，在4℃下保存备用。5.如权利要求1-4所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括如下步骤：(2-1)将10μL100μMFAM-DNA缓冲溶液加入1990μLTris–HCl缓冲溶液得到500nM溶液，4℃下保存备用；(2-2)将碱性磷酸酶用0.01M，pH值为8.12且含有5mM氯化镁和0.1mM氯化锌的Tris-HCl缓冲溶液稀释得到2500U/ml，-4℃下保存备用。6.如权利要求1-5所述的荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广凤，朱升美，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34