检测核酸制造技术

本申请提供了检测目标核酸的方法和材料。提供了例如，用于检测目标核酸存在与否的方法和材料，用于检测存在于样品中的目标核酸量的方法和材料，用于检测目标核酸存在与否的试剂盒，用于检测存在于样品中的目标核酸量的试剂盒，以及制备这样的试剂盒的方法。

【技术实现步骤摘要】
检测核酸本申请是2009.08.04提交的CN200980141331.4，题为“检测核酸”的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2008年8月15日提交的美国临时申请序列号61/089,392和2009年4月6日提交的美国临时申请序列号61/166,843的优先权。在先申请的公开内容被认为是本申请的一部分，并在此引入以供参考。
技术介绍
1.
本申请涉及与检测核酸有关的方法和材料。例如，本申请涉及与用限制性内切核酸酶的酶促扩增级联检测核酸有关的方法和材料。2.
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种常用的扩增和检测核酸的技术。例如，实时PCR可用于扩增和检测样品中的少量模板DNA。通常PCR涉及向认为含有待扩增目标核酸的样品中加入一对核酸引物和热稳定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。使含有引物对和聚合酶的样品经历热循环启动链式反应，其中位于引物之间的目标核酸模板指数扩增。可用凝胶电泳等技术检测扩增的模板是否存在，或扩增的模板量可以采用涉及使用荧光标记探针的技术评估。
技术实现思路
本申请提供了检测目标核酸的方法和材料。例如，本申请提供了检测样品中目标核酸存在与否的方法和材料，检测样品中目标核酸量的方法和材料，检测样品中目标核酸存在与否的试剂盒，检测样品中存在的目标核酸量的试剂盒，以及制备该试剂盒的方法。总的说，本文提供的方法和材料可包括进行如本文所述的限制性内切核酸酶的酶促扩增级联，以迅速、低廉、灵敏、特异的方式检测目标核酸。在一些情况下，本文提供的方法和材料能够补充或代替目前基于PCR的核酸检测方法。本文提供的方法和材料能够让临床人员、专业医生、实验室人员、和研究人员检测任何类型的目标核酸。例如，本文提供的方法和材料能够用于基因定型应用，以检测核酸突变(例如单核苷酸多态性(SNP))、基因组重组和基因组表观遗传事件(例如DNA甲基化事件)，可用于诊断和预后应用，以检测病毒或微生物(例如细菌、真菌、和原生动物)，可用于基因表达应用，以检测特定细胞类型中的mRNA水平，还可用于法医学应用，以比较样品之间的一致性或评估样品来源。在一些情况下，本文提供的方法和材料可被医学/生物技术专业以外的人用于检测目标核酸。例如，本文提供的检测细菌(例如大肠杆菌)的试剂盒可以设计用作家用检测试剂盒，从而让使用者能够检测其获得的生物学样品(例如血样、黏液样品、或唾液样品)中大肠杆菌核酸的存在与否一般说，本专利技术的一个方面是一种评估样品中目标核酸的方法。该方法包括或主要由以下组成：(a)使所述样品与探针核酸接触，所述探针核酸包含扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与所述目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果所述目标核酸存在于所述样品中，所述目标核酸的至少一部分与所述探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分，(b)使所述核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，所述限制性内切核酸酶能在下述条件下在所述限制性内切核酸酶酶切位点处切开所述核酸的双链部分：所述识别性限制性内切核酸酶在所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述核酸的双链部分，从而使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的部分与所述探针核酸的至少一部分分离；(c)使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的部分与含有核酸双链部分的报道核酸接触，所述核酸双链部分含有所述扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点，所述接触的条件是其中所述扩增性限制性内切核酸酶在所述扩增性限制性内切核酸酶的所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述报道核酸，从而使所述报道核酸的一部分与所述报道核酸的至少另一部分分离，和(d)确定所述报道核酸的所述部分是否存在，其中所述报道核酸的所述部分存在表明所述样品含有所述目标核酸，其中所述报道核酸的所述部分不存在表明所述样品不含所述目标核酸。探针核酸可以是单链探针核酸。探针核酸可以结合在固相载体上。探针核酸可以直接结合在固相载体上。包含扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分通过所述步骤(b)从固相载体上释放。步骤(a)和步骤(b)是在同一区室中进行的。步骤(a)和步骤(b)在第一区室中进行，步骤(c)是在第二区室中进行。步骤(a)和步骤(b)是通过将所述样品加到含有探针核酸和识别性限制性内切核酸酶的区室中进行的。探针核酸包含(i)单链部分，单链部分含有与目标核酸序列互补的核苷酸序列，以及(ii)双链部分。探针核酸包含第一核酸链，其含有与所述目标核酸的序列互补的核苷酸序列，与含有扩增性限制性内切核酸酶的第二核酸链杂交。第一核酸链结合在固相载体上。第一核酸链可直接结合在固相载体上。第二核酸链的一部分与第一核酸链杂交，形成双链部分。包含所述扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一个部分在步骤(b)中分离，探针核酸的部分包含第一核酸链的一部分和全部第二链。包含扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分与探针核酸的至少另一部分在步骤(b)中分离，探针核酸的部分包含目标核酸的至少一部分。该方法包括在步骤(a)中使用多个所述探针核酸。该方法包括在步骤(c)中使用多个报道核酸。步骤(c)中的报道核酸相对于来自步骤(b)的含有扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分摩尔过量。在步骤(b)中与所述探针核酸的至少另一部分分离的含有所述扩增性限制性内切核酸酶的探针核酸的部分的分子数基本上与所述样品中存在的所述目标核酸的分子数成线性关系。报道核酸可结合在固相载体上。报道核酸可直接结合在固相载体上。报道核酸可包含核酸的单链部分。报道核酸可包含标记。标记可以是荧光标记、放射性标记、酶标记、或氧化还原标记。与报道核酸的所述至少另一部分分离的报道核酸的部分可包含所述标记。报道核酸可包含第一核酸链，所述第一核酸链可包含所述标记，与第二核酸链杂交。第二核酸链可结合在固相载体上。第二核酸链可直接结合在固相载体上。第一核酸链的一部分可与第二核酸链杂交，形成包含扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分。报道核酸可包含第三核酸链。第三核酸链的一部分可与所述第二核酸链杂交，形成包含扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分。报道核酸可结合在固相载体上，报道核酸的部分与报道核酸的至少另一部分分离，且含有标记，该部分在步骤(c)中从固相载体上释放。确定步骤(d)可包括检测所述标记。标记可以是荧光标记，确定步骤(d)可包括检测荧光标记。确定步骤(d)可包括用毛细电泳技术检测与报道核酸的至少另一部分分离的报道核酸的部分。步骤(a)、(b)和(c)可不经过核酸扩增。步骤(a),(b),(c),和(d)可不经过核酸扩增。确定步骤可包括确定存在于样品内的目标核酸的量。在另一个方面，本文描述了一种评估样品中的目标核酸的方法。该方法包括或主要由以下步骤组成：(a)使样品与探针核酸接触，探针核酸包含起始扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果目标核酸存在于样品中，目标核酸的至少一部分与探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶酶切位点的核酸的双链部分，(b)使核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，限制性内切核酸酶能在下述条件下在限制性内切核酸酶酶切位点处切开核酸的双链部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估样品中的目标核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)使所述样品与探针核酸接触，所述探针核酸包含扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与所述目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果所述目标核酸存在于所述样品中，所述目标核酸的至少一部分与所述探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶切割位点的核酸的双链部分，(b)使所述核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，所述识别性限制性内切核酸酶能在下述条件下在所述限制性内切核酸酶酶切位点处切开所述核酸的双链部分：所述识别性限制性内切核酸酶在所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述核酸的双链部分，从而使所述探针核酸中含有所述限制性内切核酸酶的部分与所述探针核酸的至少另一部分分离；(c)使所述探针核酸中含有所述限制性内切核酸酶的所述部分与含有扩增性限制性内切核酸酶的信号放大核酸接触，所述信号放大核酸包含扩增性限制性内切核酸酶、标记、以及含有所述限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸双链部分，所述接触的条件是其中所述限制性内切核酸酶在所述限制性内切核酸酶的所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述信号放大核酸，从而使所述信号放大核酸的第一部分与所述信号放大核酸的至少另一部分分离，其中所述第一部分包含所述标记，和(d)用所述标记确定所述第一部分的存在与否，其中所述第一部分的存在表明所述样品含有所述目标核酸，其中所述第一部分不存在表明所述样品不含所述目标核酸。...

【技术特征摘要】
2008.08.15 US 61/089,392;2009.04.06 US 61/166,8431.一种非诊断性的评估样品中的目标核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)使所述样品与探针核酸接触，所述探针核酸包含扩增性限制性内切核酸酶和在下述条件下与所述目标核酸的序列互补的核苷酸序列：如果所述目标核酸存在于所述样品中，所述目标核酸的至少一部分与所述探针核酸的至少一部分杂交，形成含有限制性内切核酸酶切割位点的核酸的双链部分，(b)使所述核酸的双链部分与识别性限制性内切核酸酶接触，所述识别性限制性内切核酸酶能在下述条件下在所述限制性内切核酸酶酶切位点处切开所述核酸的双链部分：所述识别性限制性内切核酸酶在所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述核酸的双链部分，从而使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的部分与所述探针核酸的至少另一部分分离；(c)使所述探针核酸中含有所述扩增性限制性内切核酸酶的所述部分与含有扩增性限制性内切核酸酶的报道核酸接触，所述报道核酸包含扩增性限制性内切核酸酶、标记、以及含有所述扩增性限制性内切核酸酶的限制性内切核酸酶酶切位点的核酸双链部分，所述接触的条件是其中所述扩增性限制性内切核酸酶在所述扩增性限制性内切核酸酶的所述限制性内切核酸酶酶切位点切开所述报道核酸，从而使所述报道核酸的第一部分与所述报道核酸的至少另一部分分离，其中所述第一部分包含所述标记，和(d)用所述标记确定所述第一部分的存在与否，其中所述第一部分的存在表明所述样品含有所述目标核酸，其中所述第一部分不存在表明所述样品不含所述目标核酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针核酸包含第一核酸链，所述第一核酸链含有与...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·D·史密斯，N·亚兹温科，M·施密特，
申请(专利权)人：卡斯凯德生物体系股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US