一种家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法，包括如下步骤：(1)采用PCR-SSCP-PAGE的方法查找外显子序列SNP；(2)总RNA的提取和cDNA的制备；(3)采用RT-PCR-RFLP方法鉴定印记状态；(4)目的基因蛋白水平的检测：包括石蜡组织切片的制作和免疫荧光观察；(5)亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析方法：确定猪Rasgrf1基因核心启动子区及该片段内CTCF结合区域GpG岛的分布情况，样品经亚硫酸盐处理后，设计特异性引物对其进行PCR扩增，而后测序进行甲基化分析。通过本发明专利技术所述方法对猪的Rasgrf1基因印记机制进行初步探讨，为皖南黑猪优良性状的开发和利用提供了依据。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种家猪印记基因Rasgrf1的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)采用PCR‑SSCP‑PAGE的方法查找Rasgrf1基因外显子序列SNP：I.提取皖南黑猪和巴克夏猪的DNA，进行Rasgrf1基因外显子1和外显子14部分序列的克隆；II.PCR‑SSCP方法分型；III.不同基因型个体PCR产物的纯化、克隆和测序。(2)总RNA的提取和cDNA的制备：I.正反杂交模型的建立：正交：反交：巴克夏猪与皖南黑猪♀交配产生的F1代仔猪为正交F1，皖南黑猪与巴克夏猪♀交配产生的F1代仔猪为反交F1；II.SNP位点杂合个体的筛查：出生1日龄的正反交F1代仔猪各8头，分别提取各亲本以及F1代仔猪个体的基因组DNA，用于杂合子鉴定；采用PCR‑RFLP方法，基于步骤(1)查找到的SNP位点，该SNP位点处杂合基因型的个体为F1代杂合子仔猪个体；III.总RNA的提取和cDNA的制备：提取F1代1日龄正反交仔猪各8头以及杂合子仔猪7头的14种不同组织的RNA，反转录成cDNA；7头杂合子仔猪中包括正交3头，反交4头；14种不同组织为脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、小肠、背最长肌和垂体；(3)采用RT‑PCR‑RFLP方法鉴定印记状态I.RT‑PCR‑RFLP鉴定印记状态：取F1代1日龄正交3头、反交4头杂合子仔猪的14种不同组织cDNA，利用锚定引物进行RT‑PCR；采用RT‑PCR‑RFLP方法检测杂合子仔猪各组织器官mRNA酶消化带型，并根据其亲本的基因型判断Rasgrf1基因在特定阶段和组织是父系印记还是母系印记或者不存在印记；所述锚定引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；II.q‑RT‑PCR取F1代1日龄正反交仔猪各8头的14种不同组织cDNA，利用锚定引物进行q‑RT‑PCR，检测Rasgrf1基因在14个组织，即脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胰脏、背膘、睾丸、子宫、小肠、背最长肌和垂体的mRNA表达水平；所述锚定引物对应的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；(4)目的基因蛋白水平的检测取F1代1日龄正交3头、反交4头杂合子仔猪，选取其Rasgrf1基因双等位基因表达的两种组织心和脾，单等位基因表达的两种组织肝和小肠进行Rasgrf1基因编码的蛋白质分布的研究，包括石蜡组织切片的制作和免疫荧光观察两大步骤；(5)亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析方法通过对猪Rasgrf1基因启动子活性的分析，预测核心启动子区和该片段内CTCF结合区域，经软件预测确定此两区域GpG岛的分布情况；样品经过亚硫酸盐处理后，通过设计特异性引物对其进行PCR扩增，而后测序进行基因甲基化程度分析。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁月云，殷宗俊，周杰，张晓东，刘力源，张威，张淑静，黄龙，张梦琦，付坤，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34