一对特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用制造技术

本发明专利技术提供了一对特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用，该sgRNA对由sgRNA-F和sgRNA-R组成，sgRNA-L的核苷酸序列如下1)或2)：1)序列表中的序列1所示的核苷酸序列；2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列；sgRNA-R的核苷酸序列如下3)或4)：3)序列表中的序列2所示的核苷酸序列；4)将所述3)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与3)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。本发明专利技术能大大增加外源基因定点插入的效率，为转基因猪的制备提供了稳定的平台。

【技术实现步骤摘要】
一对特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及两条特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用。
技术介绍
2010年，斯坦福大学的SimonHippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。目前类似的还有Ros26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而H11位点则不存在类似的困难，由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等及Mali等证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱靶效应，麻省理工学院FengZhang团队使用双切刻技术将Cas9的特异性提高了50倍以上(DoublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9forenhancedgenomeeditingspecificity.Cell.Ranetal，2013)，维护了Cas9在基因打靶
的地位。借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。
技术实现思路
本专利技术针对猪的H11位点设计了一对特异性识别猪H11位点的sgRNA，本专利技术还提供了其相应的编码DNA和应用。本专利技术是利用编码这对sgRNA部分序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出这对sgRNA,这对sgRNA能够特异性地识别猪H11位点。本专利技术还利用这对sgRNA引导Cas9n核酸酶(即Cas9切刻酶)对猪H11位点进行准确、高效地靶向修饰。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一对特异识别猪H11位点基因的sgRNA，由sgRNA-L和sgRNA-R组成；sgRNA-L和sgRNA-R分别由101个核苷酸组成，其中5’末端20nt的RNA片段(分别命名为sgRNA-L20和sgRNA-R20)可以识别染色体上特定的DNA序列，其余81nt称为骨架RNA片段。骨架RNA片段可形成发夹结构，与Cas9n核酸酶结合，从而引导Cas9n核酸酶切割靶标DNA单链，两个单链切口导致双链断裂(DSB)，细胞利用自身修复功能，使得靶标位点附近的序列发生变化；另外，这对sgRNA识别的DNA靶序列呈“头对头”的排布方式(即二者的5’末端相互靠近)，二者相距4bp，即有4bp的间隔。sgRNA-L的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2)：1)序列表中的序列1所示的核苷酸序列；2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列；sgRNA-R的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下3)或4)：3)序列表中的序列2所示的核苷酸序列；4)将所述3)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与3)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列；本专利技术还提供了编码上述特异识别猪H11位点的sgRNA的DNA分子。上述的DNA分子由编码sgRNA-L的DNA分子和编码sgRNA-R的DNA分子组成。进一步的，上述的DNA分子由编码sgRNA-L的DNA分子甲和编码sgRNA-R的DNA分子乙组成。其中，上述DNA分子甲的核苷酸序列由序列表中的序列3所示。其中，上述DNA分子乙的核苷酸序列如序列表中的序列4所示。本专利技术的另一个目的是提供该对sgRNA在特异识别和靶向修饰猪H11基因中的应用。所述的猪H11基因，其核苷酸序列是如序列表中的序列5所示。本专利技术的再一个目的是该对特异sgRNA在构建猪H11基因突变库中的应用。所述的猪H11基因，其核苷酸序列如序列表中的序列5所示。本专利技术提供的一对特异识别猪H11基因的sgRNA，特异性强，能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象，能大大增加外源基因定点插入的效率，进而减少非特异性切割所引起的基因组非靶向位点的突变带来的影响。且本专利技术提供的一对该sgRNA的编码DNA片段，能通过Cas9系统在细胞或个体水平上对猪H11基因进行敲除或修饰，以解析猪H111基因的功能、构建猪H11基因突变库,为培育优良品系的猪提供前期技术支持，为转基因猪的制备提供了稳定的平台。附图说明图1为凝胶电泳检测分析酶切载体结果图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的前提下，对本专利技术所作的修饰或者替换，均属于本专利技术的范畴。实施例1sgRNA表达质粒对的构建1、sgRNA靶点设计根据小鼠的H11位点，找到猪的Eif4与Drg基因(小鼠的位点位于该两基因中间)，在NCBI中调出中间区域找出猪H11位点，其核苷酸序列如序列表中的序列5所示，根据PAM序列选择用于基因敲除的sgRNA靶点，PAM序列为NGG：sgRNA-L靶位点位置1(命名为H11-sgL2):AGATCAGGGTGGGCAGCTCTGGG，相对应的sgRNA-L序列中识别该靶点的核苷酸序列如序列表中的序列1所示；编码该上述序列的DNA序列如序列表中的序列3所示。sgRNA-R靶位点位置2(命名为H11-sgR1):TTCCAGGAACATAAGAAAGTAGG，相对应的sgRNA序列中识别该靶点核苷酸序列如序列表中序列2所示；编码该上述序列的DNA序列如序列表中的序列4所示。两个靶序列呈“头对头”的排布方式，二者相距4bp，即有4bp的间隔。2、sgRNA表达质粒对的构建首先根据靶序列设计引物序列，后送至北京天一辉远生物科技有限公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：(1)H11-sgL2:H11-sgL2-F：CACCGAGATCAGGGTGGGCAGCTCTH11-sgL2-R:AAACAGAGCTGCCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对特异识别猪H11位点的sgRNA，其特征在于，由sgRNA‑L和sgRNA‑R组成，sgRNA‑L和sgRNA‑R其序列分别包括识别染色体上特定的DNA序列片段和骨架RNA片段；sgRNA‑L的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下1)或2)：1)序列表中的序列1所示的核苷酸序列；2)将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列；sgRNA‑R的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列如下3)或4)：3)序列表中的序列2所示的核苷酸序列；4)将所述3)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有与3)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一对特异识别猪H11位点的sgRNA，其特征在于，由sgRNA-L和sgRNA-R组成，sgRNA-L和sgRNA-R其序列分别由识别染色体上特定的DNA序列片段和骨架RNA片段组成；sgRNA-L的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列为序列表中的序列1所示的核苷酸序列；sgRNA-R的识别染色体上特定的DNA序列片段的核苷酸序列为序列表中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨述林，阮进学，李奎，李和刚，牟玉莲，吴添文，魏景亮，徐奎，黄雷，周荣，刘楠，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11