作为疫苗的艰难梭菌多肽制造技术

本发明专利技术提供了用于预防或治疗哺乳动物中艰难梭菌感染的方法、蛋白质、核酸和抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来源于艰难梭菌(C.difficile)的多肽，特别是使用该多肽治疗和预防艰难梭菌感染的方法。
技术介绍
艰难梭菌是一种革兰氏阳性、杆状、厌氧产孢子细菌。第一个完全测序的艰难梭菌基因组公开于2006年[1]，并鉴定到了3776个预测的编码序列。艰难梭菌是肠道菌群的常见组分，在没有疾病迹象的情况下估计占总群体的3％。在肠道菌群的天然平衡受到干扰时，艰难梭菌会变得更为普遍。该过度生长导致细菌开始在群体信号调节因子的控制下生产毒素。干扰肠道菌群天然平衡的最常见原因是给予了有害于一些肠道细菌但不影响艰难梭菌的抗生素。艰难梭菌是抗生素相关腹泻(AAD)的主要原因，但症状可发展至威胁生命的伪膜性肠炎。在老年住院患者中感染的流行程度最高，但在非典型组(如青少年和妊娠女性)中感染逐渐增多[2]。已观察到那些艰难梭菌感染者中有12％至35％在2个月内复发[3]。在20世纪70年代，艰难梭菌仅被鉴定为AAD的致病物。从那以后，尝试了多种用于对抗感染的策略。特定的抗生素(如万古霉素、甲硝唑、硝唑尼特、杆菌肽或梭链孢酸)最初被用于治疗艰难梭菌感染，并且沿用至今(参见参考文献4、5和6)。但是，使用这些抗生素进行广泛治疗是不利的，因为艰难梭菌存在风险，也因为随着时间推移，其他肠道细菌也变得耐药。最近，已适用基于细菌分泌的类毒素的疫苗和靶向这类毒素的被动免疫治疗来进行治疗。在18-85岁患者的II期试验中测试了含和不含佐剂的类毒素疫苗以确定在给予第三次剂量的该疫苗后9周时该疫苗预防复发性CDI的效力。类毒素疫苗通常需要重复给药和佐剂以引发免疫应答。此外，其给药通常与注射位点免疫反应相关。然而，基于毒素的疫苗仅预防毒素结合，中和炎性作用；这类疫苗通常不能完全预防建群或从身体中清除存在的病原体。例如，孢子可能剩余，这表明可能发生具有相关症状的进一步感染或感染复发。因此，需要改善的用于治疗或预防艰难梭菌感染的组合物和方法。具体而言，需要可用作疫苗组分并可用于在疫苗接种对象中限制或消除建群(包括孢子)以进一步预防艰难梭菌传递的多肽。本专利技术的目的是提供能够有效产生针对艰难梭菌的免疫应答的多肽和组合物，其用于研发预防和/或治疗艰难梭菌相关疾病的疫苗。图1：提供了各经选择多肽的概要信息，包括内部名称、基因标识符(GI)、基因座标记、氨基酸序列长度(AA)、最初从中分离出多肽的菌株标识名称、对应于各多肽的SEQ ID NO、克隆的多肽和多个引物的SEQ ID NO。图2：总结了分泌组、NMR和共聚焦显微实验的结果。图3：提供了NMR分析中所用方法的示意图。图4：Diff44的15N-HSCQ谱图5：显示了通过Western印迹进行的表面暴露研究的结果图6：提供了Dif232的代表性FACS数据图7：提供了涉及细胞结合实验的数据总结。通过FACS分析进行的人Vero细胞上重组多肽和通过共聚焦显微分析进行的人Vero和Caco-2细胞上重组多肽的结合试验图8：采用抗Dif192和抗Dif44抗体对艰难梭菌参考菌株(630、R20291和M120)的总细胞提取物和代表不同PCR核糖体型的临床分离物进行的Western印迹分析。Dif192成熟形式是647aa和71.1kDa。Dif44成熟形式是286aa和31kDa。图9：提供了涉及ELISA结合试验的结果总结图10：通过Western印迹，对艰难梭菌重组多肽(100ng)进行识别，(A)仓鼠的血清，使用毒素A和B联合疫苗接种并使用艰难梭菌630菌株或B1菌株攻击的仓鼠的血清，(B)未感染的仓鼠的血清。图11：人血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。图12：人血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。图13：人血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。图14：小鼠血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。使用由浓缩的上清液(5)Dif183(CD3669)免疫的小鼠的血清对重组蛋白进行免疫印迹。图15：Dif153和炭疽热致死因子的C端(残基589-810)之间的比对；Dif153与炭疽热致死因子的C端同源；与PA相互作用所必需的N端结构域缺失；催化位点(HEXXH)是保守的。图16：荧光测定试验显示在锌存在的情况下Dif153的明胶酶/胶原酶活性较弱。图17：含量递减的重组Dif153与同一量的所需底物(胶原I-VI，纤连蛋白)孵育。该反应在0,5mM ZnCl2存在的条件下在37℃下进行16小时。将反应产物加载到凝胶上用于SDS-PAGE，随后使用银或考马斯染色。图18：Dif183含有GerMN结构域。图19：(A)使用抗Dif183血清对菌株630细胞组分进行的Western印迹分析；(B)对菌株630营养细胞的免疫荧光分析。图20：通过Western印迹分析培养物上清组分中是否存在Dif183。图21：Dif183缺失突变体具有孢子形成/萌发表型。图22：优选的艰难梭菌重组毒素片段的示意图。ED＝酶结构域；GT＝葡糖基转移酶结构域；CP＝半胱氨酸蛋白酶结构域；T–易位结构域；B＝结合结构域。所有结构域都是可溶的，不同之处在于TcdA的T4和PTA2结构域是不可溶的。图23：显示了给予具有Dif44或Dif208的毒素片段抗原并随后进行艰难梭菌630攻击后，经疫苗接种的动物的温度波动。图24：显示了使用毒素片段抗原联合Dif44或Dif208进行疫苗接种的动物中，在艰难梭菌攻击后收集的粪粒中观察到的艰难梭菌数目(CPU/100mg)。图25：显示了对于使用毒素片段抗原联合Dif44或Dif208进行疫苗接种并随后进行艰难梭菌630攻击的动物，在实验终点时盲肠腔(Cae-LA)、结肠腔(Col-LA)、盲肠组织(Cae-TA)和结肠组织(Col-TA)中艰难梭菌的数目。图26：显示了所有经疫苗接种的组在实验终点(攻击后第14天)时分离的艰难梭菌总数。图27：显示了实验终点时肠道样品中的毒素效价。图28：显示了来自实施例15的仓鼠1-5的(A)血清或(B)结肠和直肠洗出物对重组ToxAp5_6、ToxB_GT和Dif44的识别。图29：显示了来自实施例15的仓鼠6-10的(A)血清或(B)结肠和直肠洗出物对重组ToxAp5_6、ToxB_GT和Dif208的识别。图30：显示了来自实施例15的仓鼠1-5的血清对各种细胞壁蛋白(cwp)的识别。
技术实现思路
本专利技术提供了包含选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫原性组合物，其包含：a)选自Dif44和Dif208的艰难梭菌(C.difficile)多肽，b)编码a)中所述多肽的核酸分子，和/或c)能够结合至a)中所述多肽的抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.09.19 GB 1216748.2;2012.09.19 GB 1216749.01.一种免疫原性组合物，其包含：
a)选自Dif44和Dif208的艰难梭菌(C.difficile)多肽，
b)编码a)中所述多肽的核酸分子，和/或
c)能够结合至a)中所述多肽的抗体。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含至少一
种艰难梭菌ToxB-GT抗原和至少一种艰难梭菌TcdA抗原，编码所述抗原的核酸
分子和/或能够结合至所述抗原的抗体。
3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，所述ToxB-GT抗原和/或TcdA抗原
是脱毒的。
4.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述Dif44多肽包含如
下氨基酸序列，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:79具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:79的至少7个连续氨基酸的片段，或者
是与SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:79具有80％或更高相同性且包含SEQ ID NO:
139或SEQ ID NO:79的表位的多肽片段。
5.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述Dif208多肽包含氨
基酸序列，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:433或SEQ ID NO:133具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:433或SEQ ID NO:133的至少7个连续氨基酸的片段，或
者是与SEQ ID NO:433或SEQ ID NO:133具有80％或更高相同性且包含SEQ ID 
NO:433或SEQ ID NO:133的表位的多肽片段。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，所述片段包含与SEQ ID NO:111、
SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:173具有80％或更高相同性的氨基
酸序列。
7.如权利要求2-6中任一项所述的免疫原性组合物，所述ToxB-GT抗原是包
含或由如下氨基酸序列或由其组成的多肽，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的至少7个连续氨基酸的片段，或者
是与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更高相同性且包含SEQ ID NO:
18或SEQ ID NO:60的表位的多肽片段。
8.如权利要求2-7中任一项所述的免疫原性组合物，所述TcdA抗原是包含如
下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:11、1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或16
具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:11、1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或16
中任一条的至少7个连续氨基酸的片段，或者是与SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·加莱奥蒂，R·里犹兹，M·皮萨，M·斯卡塞利，M·乌尼克里西南，M·马丁内利，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH