一种海绵细胞膜提取物及其作为血管紧张素转化酶抑制剂的应用制造技术

本发明专利技术公开一种对ACE酶具有抑制活性的海绵细胞膜提取物的制备方法。该海绵细胞膜提取物主采用差速离心的方法，先后经过5次离心制备得到纯度较高的细胞膜提取物。并将此细胞膜提取物进行了ACE酶抑制活性实验。实验结果表明：海绵细胞膜提取物对ACE酶的抑制活性是随着其浓度的增加而增长的。且在浓度达到30mg/mL时抑制率达到最大，约为93.58%。因此，可以根据本制备方法得到的海绵细胞膜提取物研发具有降血压活性的药物和保健品等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种海绵细胞膜提取物，以及该种海绵细胞膜提取物作为血管紧张素转化酶抑制剂的应用。
技术介绍
海绵是世界上第一也是最原始的多细胞动物，其种类至今已发展到1万多种，占海洋动物种类的1/15，是一个庞大的海洋“家族”。正是由于其数量巨大，种类众多，为海洋天然产物的研究提供了可能。八十年代初用于海绵天然产物的活性研究的样品主要是萃取混合物，如刘锡金、方振生等研究了一些海绵萃取液的生物活性。在其论文中所涉及的方法虽然对进一步分离得到相关的活性物质有一定指导作用，但还是会忽略海绵中可能存在的其它活性物质。目前已经从海绵中发现的天然产物包括甾醇、萜类、脂肪醇甘油醚、生物碱和长链酰胺等。除此之外，也在海绵中发现了大量具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性物质。但整体说来，我国对海绵的研究还处于起步阶段，不但分离出来的生理活性物质较少，而且也还没有发现真正能应用于临床的药物。血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme，简称ACE），主要参与的是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的调节。ACE在催化血管紧张素I（angiotensin I）转变为具有强效升高血压作用的物质——血管紧张素II（angiotensin II）。因此，寻找抑制ACE活性的物质和组分是扩张外周血管、降低总外周阻力和降低血压的重要途径。心脑血管疾病是威胁当代人类健康的主要疾病，高血压是其中的分类体征之一，面对高血压发病率的不断增长，越来越多的医药研究致力于血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensinconverting enzyme inhibitor，简称ACEI)的发现与研发，而在此过程中实现抑制剂降压效果体外检测的重要途径就是测试其对ACE活性的抑制作用。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种海绵细胞膜提取物，以及该种海绵细胞膜提取物作为血管紧张素转化酶抑制剂的应用。本专利技术的技术解决方案是：一种海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细胞膜提取物按照以下步骤制备获得：a、用纯水清洗去冰冻的海绵组织表面的杂物，将海绵组织粉碎并匀浆，获得海绵匀浆，b、将海绵匀浆与纯水按照1:1的体积比混合获得稀释海绵匀浆，向稀释海绵匀浆中加入蛋白酶K溶液以获得混合溶液，使混合溶液中蛋白酶K的浓度范围在200.0~270.0μg/mL之间，在52~57℃的温度下使混合溶液酶解80~95min，获得海绵酶解浆液，对海绵酶解浆液进行过滤，去除滤渣，获得海绵酶解液，c、将海绵酶解液在6~12℃的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A1，将A1用纯水溶解后，再一次在6~12℃的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A2，将A2用纯水溶解后置入匀浆器中，以间隔30s的方式均质化120s，然后在6~12℃的温度下以600g离心15min，弃去沉淀得到上清液B1，将上清液B1在2~6℃的温度下以15000g离心20~25min，弃去沉淀得到上清液B2，将上清液B2在2~6℃的温度下以100000g离心40~50min，弃去上清液得到沉淀组分A3，沉淀组分A3即为海绵细胞膜提取物。一种如上所述的海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细胞膜提取物作为血管紧张素转化酶抑制剂的应用。所述的海绵组织选用南海多皱软海绵的海绵组织。本专利技术同现有技术相比，具有如下优点：本申请所公开的海绵细胞膜提取物的制备方法具有快速、提取效率高等特点，并且该提取物来自于海洋中的天然产物——海绵，属于非经济类生物，其经济成本较低，容易获得。另外，本提取物与其他同类的天然提取物相比，具有高ACE酶抑制活性，效果更好。综上所述，本方法以及利用本方法制备的提取物具有多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场前景十分广阔。附图说明图1为本专利技术实施例的海绵细胞膜提取物在荧光显微镜下的图片。图2为不同浓度下的海绵细胞膜提取物与ACE酶抑制活性的关系曲线。具体实施方式下面将结合附图说明本专利技术的具体实施方式。如图1、图2所示：一种海绵细胞膜提取物，按照以下步骤制备获得：首先用纯水清洗去冰冻的海绵组织表面的杂物，将海绵组织粉碎并匀浆，获得海绵匀浆；将海绵匀浆与纯水按照1:1的体积比混合，获得稀释海绵匀浆，向稀释海绵匀浆中加入蛋白酶K溶液，并混合均匀，最终保证混合溶液中蛋白酶K的浓度范围在200.0~270.0μg/mL之间，并在52~57℃的温度下使混合溶液酶解80~95min，获得海绵酶解浆液，对海绵酶解浆液进行过滤，去除滤渣，获得海绵酶解液；将海绵酶解液在6~12℃的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A1，将A1用纯水溶解后，再一次在6~12℃的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A2，将A2用纯水溶解后置入匀浆器中，以间隔30s的方式均质化120s，然后在6~12℃的温度下以600g离心15min，弃去沉淀得到上清液B1，将上清液B1在2~6℃的温度下以15000g离心20~25min，弃去沉淀得到上清液B2，将上清液B2在2~6℃的温度下以100000g离心40~50min，弃去上清液得到沉淀组分A3，沉淀组分A3即为海绵细胞膜提取物。利用上述方法所获得的海绵细胞膜提取物，可以作为血管紧张素转化酶（ACE酶）的抑制剂而应用。下面利用上述的海绵细胞膜提取物进行血管紧张素转化酶（ACE酶）的抑制活性实验：称取适量的细胞膜提取物，加入浓度为1%的甲醇水溶液，配制成一定浓度的细胞膜提取物溶液。然后分别移取5μL细胞膜提取物溶液于离心管中，并置于37℃水浴中。接着加入ACE 缓冲液15μL，37℃条件下震荡反应5分钟后加入25μL HHL溶液（马尿酰-组胺酰-亮氨酸的浓度为7.6mmol/L，pH=8.3），震荡反应30分钟。然后加入5μL的10%三氟乙酸终止反应，得到反应液样品。将上述反应液在4℃条件下以6745×g离心20min，取上清液直接进行HPLC分析。由ACE作用底物得到的马尿酸通过HPLC进行定量分析。同时作空白试验，除加等量1%甲醇水溶液替代样品外，其他操作相同。实验结果表明：海绵细胞膜提取物对ACE酶的抑制活性是随着其浓度的增加而增长的。且在浓度达到30mg/mL时抑制率达到最大，约为93.58%。随后，随着细胞膜提取物浓度的增加，抑制率保持不变，约为93.06%。实验例1：配制海绵细胞膜样品浓度梯度为20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00mg/mL，测定此系列样品及空白对照组中马尿酸的峰面积，具体数据如表1所示。从表中可知，该梯度浓度系列的海绵细胞膜样品对ACE的抑制率都高达90%以上，并且在该系列浓度梯度范围内并没有体现出明显的抑制活性的变化。实验例2：配制海绵细胞膜提取物梯度浓度为0.50、1.25、2.50、5.00、10.00mg/mL，测定其相应的ACE酶抑制率，其结果如表2所示。表中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细胞膜提取物按照以下步骤制备获得：a、用纯水清洗去冰冻的海绵组织表面的杂物，将海绵组织粉碎并匀浆，获得海绵匀浆，b、将海绵匀浆与纯水按照1:1的体积比混合获得稀释海绵匀浆，向稀释海绵匀浆中加入蛋白酶K溶液以获得混合溶液，使混合溶液中蛋白酶K的浓度范围在200.0~270.0μg/mL之间，在52~57℃的温度下使混合溶液酶解80~95min，获得海绵酶解浆液，对海绵酶解浆液进行过滤，去除滤渣，获得海绵酶解液，c、将海绵酶解液在6~12℃的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A1，将A1用纯水溶解后，再一次在6~12℃的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A2，将A2用纯水溶解后置入匀浆器中，以间隔30s的方式均质化120s，然后在6~12℃的温度下以600g离心15min，弃去沉淀得到上清液B1，将上清液B1在2~6℃的温度下以15000g离心20~25min，弃去沉淀得到上清液B2，将上清液B2在2~6℃的温度下以100000g离心40~50min，弃去上清液得到沉淀组分A3，沉淀组分A3即为海绵细胞膜提取物。...

【技术特征摘要】
1.一种海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细胞膜提取物按照以下步骤制备获得：
a、用纯水清洗去冰冻的海绵组织表面的杂物，将海绵组织粉碎并匀浆，获得海绵匀浆，
b、将海绵匀浆与纯水按照1:1的体积比混合获得稀释海绵匀浆，向稀释海绵匀浆中加入蛋白酶K溶液以获得混合溶液，使混合溶液中蛋白酶K的浓度范围在200.0~270.0μg/mL之间，在52~57℃的温度下使混合溶液酶解80~95min，获得海绵酶解浆液，对海绵酶解浆液进行过滤，去除滤渣，获得海绵酶解液，
c、将海绵酶解液在6~12℃的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A1，将A1用纯水溶解后，再一次在6~12℃的温度下以600g离...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔亮，刘琪，李伟，谭成玉，
申请(专利权)人：大连海洋大学，孔亮，
类型：发明
国别省市：辽宁;21