一种采用非溶剂脱脂制备脑蛋白水解物的方法技术

本发明专利技术公开一种采用非溶剂脱脂制备脑蛋白水解物的方法，包括(1)组织匀浆；(2)脱脂；(3)清洗过滤；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤。所述的脱脂方式为采用磷脂酶和脂肪酶进行酶解，解决了现有方法使用有机溶剂脱脂造成溶剂残留和环境危害的问题，同时意外的解决了脑蛋白水解液多肽含量低问题，本方法所得水解液多肽含量达90％以上，符合国家标准。

【技术实现步骤摘要】
一种采用非溶剂脱脂制备脑蛋白水解物的方法
本专利技术涉及药品和保健食品领域，特别涉及一种脑蛋白水解物的制备方法。
技术介绍
脑蛋白水解物是将动物脑组织经酶水解后获得的一种活性多肽，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。脑蛋白水解物的基本生产工艺如下；动物脑组织去除表面的粘膜及血渍后，加水匀浆，脱脂，胃蛋白酶酶解，胰蛋白酶酶解，超滤。此工艺中脱脂并非必须步骤，脑组织匀浆后亦可直接进行酶解，例如中国专利200410073403.5、201110227333.4，不脱脂直接酶解有三大缺陷，一是大量脂肪包裹蛋白未被水解，水解液活性肽收率和含量下降，同时产品中混有大分子量致敏物质；二是产品脂肪含量较高，影响产品稳定性和外观；三是后续工序过滤困难。因此，对脑组织匀浆液进行脱脂有助于提高产品质量和收率，丙酮或丙酮复合溶剂脱脂是最常见的脱脂方式，例如中国专利200410043939.2，94104516.1，这种脱脂方式的危害是大量使用有机溶剂，造成环境危害和溶剂残留。为避免溶剂脱脂，中国专利201310113215.X使用乳脂分离机加硅藻土的方式进行脱脂，避免了有机溶剂的使用，但这种方式脱脂造成活性多肽收率下降并增加设备投入成本。中国专利201210242784.X使用二氧化碳超临界萃取方式脱脂，不造成环境危害，但超临界萃取设备庞大，价格高昂，产量极低，限制了工业化应用。此外，采用现有技术中生产工艺所制备脑蛋白水解液含氮量低，国家药品标准WS1-XG-025-2000规定，干燥后物质含氮量为8％-10％，换算成氨基酸+多肽含量在60％左右，40％的未知非氨基酸+多肽类物质造成的潜在临床风险可想而知，因此国家食品药品监督管理局对此类产品的标准在不断提高，逐步淘汰落后产品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脑蛋白水解物的制备方法。其包括以下步骤：(1)组织匀浆；(2)脱脂；(3)清洗过滤；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤。(1)组织匀浆：冷冻或新鲜哺乳动物脑，清洗，加水匀浆；(2)脱脂：上述匀浆液中加入磷脂酶和脂肪酶进行酶解，可以分步进行酶解，亦可同时加入进行酶解，这两种酶的用量分别为脑重量的0.1‰～2.0‰，酶解温度4℃-40℃，酶解时间0.5-5小时。优选的，每种酶用量为脑重量的1‰，温度30℃，酶解时间1.5小时。(3)清洗过滤：将步骤(2)所得酶解液过滤，滤饼加入酶解液2-20倍重量水，水温4℃-40℃，搅拌10min-60min，过滤，同法清洗3次。优选的，使用3倍量水，水温保持20℃左右。(4)胃蛋白酶酶解：将步骤(3)所得滤渣加水匀浆，盐酸调整pH＝1-3，升温至35℃-45℃，加入脑重量1％～3％的胃蛋白酶，搅拌，水解10-20小时，冷却，过滤，得胃酶水解液；优选的，调节pH＝2，温度40℃，加入脑重量1.5％的胃蛋白酶，水解15小时。(5)胰蛋白酶酶解：将步骤(4)胃酶水解液用NaOH调整pH＝7-9，升温至40℃-60℃，加入脑重量1％～3％的胰蛋白酶酶解，搅拌，水解2-10小时，完毕加热微沸10min灭活，冷却，过滤，得胰蛋白酶水解液；优选的，调节pH＝7.6～8.0，温度45℃，加入2％脑重量的胰蛋白酶，水解5小时。(6)超滤：将步骤(5)所得酶解液，调节pH值至中性(6.5-7.5)，用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行超滤，收集分子量小于10000道尔顿的液体，所得超滤液即脑蛋白水解物。本专利技术所述的哺乳动物系指人除外的其他哺乳动物，包括猪、牛、马、羊、兔、狗等，优选猪、牛、羊。步骤(2)所用的磷脂酶包括动物性磷脂酶、微生物磷脂酶，脂肪酶包括动物性脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、微生物脂肪酶。本专利技术进一步要求保护本专利技术的脑蛋白水解物与一种或多种载体和/或稀释剂制的药物及保健品组合物，可以制成市场上可接受的任一剂型。用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等，也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。本专利技术进一步要求保护本专利技术的脑蛋白水解物在制备治疗和/或预防脑功能障碍的药物和/或保健品中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：(1)本专利技术选用磷脂酶和脂肪酶处理脑组织，首先通过磷脂酶破坏脂肪细胞外层，再由脂肪酶水解脂肪，所得脑蛋白水解物无溶剂残留，脱脂彻底，活性多肽收率高，酶解液过滤容易，无需添加设备，费用低廉，适合工业化生产。(2)本专利技术解决脑组织脱脂问题的同时，意外的发现，本专利技术所采用的脱脂方式有助于提高最终产品的多肽含量，本专利技术较现有技术产品氮含量提高50％以上，有效降低产品临床或日常使用的风险。具体实施方式下面详细叙述本专利技术的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。比较实施例1分别采用不同脱脂方式进行实验，比较最终产品收率、活性多肽含量、过滤难易、溶剂残留、脂肪含量。步骤如下：(1)猪脑匀浆；(2)脱脂；(3)胃蛋白酶酶解；(4)胰蛋白酶酶解；(5)超滤，即得。步骤(2)中采用的脱脂方式及对应获得的产品如表中所示：*以干物质计；**实际为多肽+游离氨基酸含量，以凯氏定氮法测定氮含量乘以6.25计算结果表明，不脱脂产品脂肪含量最高，收率和有效物质含量最低，过滤困难，混合溶剂脱脂效果较好，但采用常规工艺，有效物质含量低，残留有毒有害物质，单用脂肪酶脱脂效果不彻底，最佳方案为磷脂酶+脂肪酶脱脂，所得产品脂肪含量低，绿色环保，有效物质含量高，工艺操作简单。实施例1将新鲜猪脑去除脑膜和血管，用水洗净，沥干，胶体磨磨细，收集匀浆液，加入猪脑3倍重量的注射用水、1‰重量的磷脂酶(LecitaseUltra)及1‰重量的脂肪酶(天津诺奥酶制剂有限公司)，搅拌下30℃酶解3小时，酶解液冷却至18℃，过滤，滤饼加入5倍量冷注射用水(水温不超过20℃)搅拌30min，过滤，滤饼用同样方法再清洗2遍，置入酶解罐，加入2倍重量注射用水，升温至42℃，用4.5％盐酸调pH＝1.5，加入脑重量1.5％的胃蛋白酶，维持pH＝1.5-1.7，水解8小时，用5MNaOH将胃蛋白酶水解浆液调pH至7.8，加入脑重量1.5％的胰蛋白酶，搅匀后，pH值维持在7.5-8.0，42℃水解4小时，酶解结束后加热升温至微沸，保持10min，冷却降温，离心机离心，将离心后的上清液经超滤器一万分子量截留膜超滤，得淡黄色澄明溶液，即猪脑蛋白水解物。按以上工艺制得的脑蛋白水解物干物质含氮量14.5％，脂肪含量0.09％，按照国家药品标准WS1-XG-025-2000进行高效液相色谱法检验，本工艺制备的脑蛋白水解物溶液的色谱图与对照的脑蛋白水解物的标准色谱图一致。实施例2将新鲜猪脑去除脑膜和血管，用水洗净，沥干，胶体磨磨细，收集匀浆液，加入猪脑3倍重量的注本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脑蛋白水解物制备方法，包括如下步骤：(1)组织匀浆；(2)脱脂；(3)清洗过滤；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤。其特征在于，步骤(2)所述的脱脂采用磷脂酶和脂肪酶进行酶解。

【技术特征摘要】
1.一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：(1)组织匀浆；(2)脱脂；(3)清洗过滤；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超滤；其特征在于，步骤(2)所述的脱脂采用磷脂酶和脂肪酶进行酶解，酶解温度为35℃～50℃，酶解时间0.5～5小时，所述磷脂酶的用量为脑重量的0.1‰～2.0‰，所述脂肪酶的用量为脑重量的0.1‰～2.0‰。2.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述磷脂酶的用量为脑重量的1‰，所述脂肪酶的用量为脑重量的1‰。3.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，磷脂酶和脂肪酶同时加入进行酶解。4.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，磷脂酶和脂肪酶分别加入进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：林波，王欣，宫晓辉，于秀玲，孔新颖，韩风雨，
申请(专利权)人：内蒙古天奇生物科技有限公司，内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，内蒙古天奇药业投资集团有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15