一种检测椰子蛋白的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测椰子蛋白的酶联免疫试剂盒。发明专利技术人从椰子果肉中分离纯化制备得到20～25kDa，等电点为6～8的椰子特异性蛋白，其纯度满足免疫要求。同时利用该椰子特异性蛋白诱导产生椰子特异性蛋白抗体，并进一步制备检测椰子蛋白的酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所制备的试剂盒中椰子特异性蛋白抗体针对的抗原决定簇耐热，可对椰子及其相关产品进行蛋白定量检测，适用范围广，有利于消费者合法权益的保障；特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复性好；样品的前处理简单，检测操作简单，试剂均以工作液的形式提供，可方便地进行大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测椰子蛋白的酶联免疫试剂盒。专利技术人从椰子果肉中分离纯化制备得到20～25kDa，等电点为6～8的椰子特异性蛋白，其纯度满足免疫要求。同时利用该椰子特异性蛋白诱导产生椰子特异性蛋白抗体，并进一步制备检测椰子蛋白的酶联免疫试剂盒。本专利技术所制备的试剂盒中椰子特异性蛋白抗体针对的抗原决定簇耐热，可对椰子及其相关产品进行蛋白定量检测，适用范围广，有利于消费者合法权益的保障；特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复性好；样品的前处理简单，检测操作简单，试剂均以工作液的形式提供，可方便地进行大量样本的筛查。【专利说明】-种检测柳子蛋白的酶联免疫试剂盒
本专利技术设及食品安全检测领域，具体设及食品中挪子蛋白的快速定量检测。
技术介绍
挪子蛋白饮料具备"天然、绿色、营养、健康"的品类特征，符合饮料市场发展潮流 和趋势，深受消费者的喜爱，消费人群正在快速增长。不少企业看好挪子蛋白饮料的市场纷 纷进入该领域并取得不小的佳绩。然而随着植物蛋白饮料的快速发展，挪子蛋白饮料中植 物蛋白的含量造假的报道越来越引起关注，消费者报道杂志2014年3月18日刊文披露，部 分挪子蛋白饮料产品W =聚氯胺冒充蛋白，并且指出植物蛋白饮料真实的植物蛋白含量存 疑。固体饮料一一挪子粉也深陷奶精口。据中国食品安全报2014年3月14日报道，海风 堂和春光速溶挪子粉的植物蛋白含量存在严重问题，挪子汁含量极低。 造成该种乱象和质疑的根本原因在于缺少植物蛋白饮料中所含有植物蛋白的定 量方法。国家标准GB 16322-2003《植物蛋白饮料卫生标准》规定植物蛋白饮料中的蛋白 质含量应不低于5g/L。由于技术所限，目前只能依据凯氏定氮法对其总蛋白进行定量。凯 氏定氮法是通过测定样品中总氮的含量推算出蛋白含量。该就导致了不法分子可W =聚氯 胺等高氮小分子非法添加物冒充植物蛋白，或W大豆蛋白、牛奶蛋白等相对廉价的蛋白渗 伪价格较高的挪子蛋白。植物蛋白饮料对其总氮的测定不能真实反映添加的植物蛋白的含 量或者乳蛋白含量。该不仅设及到欺骗消费者，更严重的是渗伪过程因风味常需要添加过 量的或非法的香精香料，极大威胁食品安全。 目前，对于食品中的挪子蛋白含量的测定方法目前国内外还未见相关报道。植物 生物属性鉴定主要通过PCR法，所见报道一般用于过敏原成分的检测。但由于DNA在细胞 中的拷贝数不一致，DNA在食品热加工中部分断裂等缺点，因此，PCR方法只适用于定性检 巧。，定量检测准确性较差，导致渗伪产品无法鉴别。因此，为客观准确定量食品中的挪子蛋 白，迫切需要建立能检测挪子蛋白含量的方法。
技术实现思路
本专利技术设及一种检测挪子蛋白的酶联免疫试剂盒。 本专利技术所采取的技术方案是： 一种挪子特异性蛋白的纯化方法，包括W下步骤： 1) 蛋白提取；将挪子果肉用粉碎机粉碎后，取部分样品，使用缓冲液超声提取5?7小 时，去除杂质后得到上清液； 2) 初次分离纯化：对上清液利用等电聚焦仪进行初次分离纯化，截取等电点为6?8 的组分； 3) 二次分离纯化：初分离的样品使用SDS-PA(iE聚丙締酷胺凝胶电泳分别进行浓缩和 分离，75?85V电泳1. 5?2.化后，切取分子量为20?25kDa的蛋白凝胶条带； 4) 回收制备；将蛋白凝胶使用研鉢粉碎后，加入电洗脱仪，使用洗脱缓冲液对目标蛋 白进行洗脱，而后透析和冻干得到目标蛋白，记为挪子中性糖蛋白。 进一步的，步骤1)所述的缓冲液为Tris-肥1 Buffer缓冲液，其配方为50mM Tris-HCl，P服.8,1. 5mM KC1，lOmM DTT。 [000引进一步的，步骤3)所述的SDS-PAGE聚丙締酷胺凝胶电泳分别是4%的浓缩胶和 12%的分离胶。 进一步的，步骤3)中的洗脱缓冲液为7M的尿素溶液，洗脱电流为10A。 一种挪子蛋白特异性抗体，由上述方法纯化得到的挪子中性糖蛋白直接或间接诱 导动物体产生。 进一步的，所述挪子蛋白特异性抗体为单克隆抗体。 一种检测挪子蛋白的酶联免疫试剂盒，包括包被了挪子中性糖蛋白的酶标板、抗 挪子中性糖蛋白酶标抗体、底物显色液、终止液和挪子中性糖蛋白标准液，其特征在于：所 述酶联免疫试剂盒中使用的抗体为权利要求5或6任意一项所述的抗体，挪子中性糖蛋白 按权利要求1?4任意一项权利要求所述的方法制备得到。 进一步的，所述检测挪子蛋白的酶联免疫试剂盒中有挪子中性糖蛋白标准液7 瓶，其浓度分别为 0 y g/血、1 y g/血、2 y g/血、4 y g/血、8 y g/mL、16 y g/mL、32 y g/血。 本专利技术的有益效果是： 1)本专利技术通过超声提取W及二次分离纯化制备得到20?25kDa，等电点为6?8的挪 子特异性蛋白。 2)本专利技术利用已制备的挪子特异性蛋白直接或间接诱导动物体产生挪子特异性 蛋白抗体，并进一步制备检测挪子蛋白的酶联免疫试剂盒。 3)本专利技术所制备的试剂盒中挪子特异性蛋白抗体针对的抗原决定簇耐热，可对 挪子及其相关产品进行蛋白定量检测，适用范围广，有利于消费者合法权益的保障；特异性 好；和其他核果、坚果蛋白及其他植物蛋白饮料中的原料蛋白无交叉反应；灵敏度高；最低 可识别1 yg/mL挪子中性糖蛋白；抗基质干扰效果好，不易受到食品中其他原辅料的干扰； 检测结果准确性好，重复性好；样品的前处理简单，检测操作简单，试剂均W工作液的形式 提供，可方便地进行大量样本的筛查。 【专利附图】【附图说明】 图1为挪子中性糖蛋白双向电泳蛋白图谱； 图2为挪子中性糖蛋白酶联免疫检测标准曲线。 【具体实施方式】 W下结合具体实验，对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。 挪子特异性蛋白的分离纯化 将挪子果肉部分粉碎机粉碎后，取样品lOOg，使用Tris-肥1 Buffer(配方；50mM Tris-肥1，P服.8,1. 5mM KC1，lOmM DTT)超声提取5?7h。离屯、取上清，使用液相等电聚焦 仪进行初次分离纯化，截取等电点为6?8的组分； 初分离得到的样品使用垂直电泳仪进行再纯化；将初分离的样品使用4%的浓缩胶和 12%的分离胶进行SDS-PA(iE聚丙締酷胺凝胶电泳，同时使用预染蛋白标准品作为分子量 参照。80V电泳化后，参照预染蛋白标准品切取分子量为20?25kDa的蛋白凝胶条带。将 蛋白凝胶使用研鉢粉碎后，加入电洗脱仪，使用7M尿素10A电流洗脱她。对收集帽中的富 集蛋白进行透析，冻干。通过双向电泳检测分析（图1)，目标蛋白为22kDa蛋白，未见其他 杂蛋白，纯度满足免疫要求。纯化得到的挪子特异性目标蛋白记名为挪子中性糖蛋白。 抗挪子中性糖蛋白抗体的制备和纯化 1) 用挪子中性糖蛋白分别免疫6周雌性ba化/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，取 lOOyg/mL的免疫抗原lOOyl，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周 后，取同样的抗原100 y 1，与等量不完全佐剂乳化，同样方法注射； 2) 在细胞融合前Id或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70%酒精中，体表消毒；用大头针 固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种椰子特异性蛋白的纯化方法，包括以下步骤： 1）蛋白提取：将椰子果肉用粉碎机粉碎后，取部分样品，使用缓冲液超声提取5～7小时，去除杂质后得到上清液；2）初次分离纯化：对上清液利用等电聚焦仪进行初次分离纯化，截取等电点为6～8的组分；3）二次分离纯化：初分离的样品使用SDS‑PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分别进行浓缩和分离，75～85V电泳1.5～2.5h后，切取分子量为20～25kDa的蛋白凝胶条带；4）回收制备：将蛋白凝胶使用研钵粉碎后，加入电洗脱仪，使用洗脱缓冲液对目标蛋白进行洗脱，而后透析和冻干得到目标蛋白，记为椰子中性糖蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赖晓芳，张世伟，赖心田，李碧芳，黄静敏，王士峰，冯荣虎，唐栋，马广东，杨国武，
申请(专利权)人：深圳市计量质量检测研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44