一种便于蛋白质谱高效分析表达量差异蛋白的蛋白提取和电泳方法技术

本发明专利技术公开了一种便于蛋白质谱高效分析表达量差异蛋白的蛋白提取和电泳方法，属于蛋白质谱工程领域。本发明专利技术发明专利技术能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分离各个蛋白质点。其中，以如下配方的低温破壁液对黑曲霉进行破碎提取蛋白：无水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸钠0.03g，蒸馏水定容至1L，该破壁液能增加蛋白的提取率。本发明专利技术的电泳方法为三向电泳，通过三向电泳更有利于黑曲霉的蛋白提取和区分蛋白表达的差异。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，属于蛋白质谱工程领域。本专利技术专利技术能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分离各个蛋白质点。其中，以如下配方的低温破壁液对黑曲霉进行破碎提取蛋白：无水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸钠0.03g，蒸馏水定容至1L，该破壁液能增加蛋白的提取率。本专利技术的电泳方法为三向电泳，通过三向电泳更有利于黑曲霉的蛋白提取和区分蛋白表达的差异。【专利说明】一种便于蛋白质谱高效分析表达量差异蛋白的蛋白提取和 电泳方法
本专利技术属于蛋白质谱工程领域，具体涉及一种便于蛋白质谱高效分析表达量差异 蛋白的蛋白提取和电泳方法。
技术介绍
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到 100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。 纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需 要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体， 是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色，条件温和，转化率高的特点， 但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。 获得高产纤维素酶的菌株，降低纤维素酶的生产成本成为纤维素酶工业化利用的 必由之路。纤维素酶的生产菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其较高的安全性，被认为是生 产纤维素酶最有应用前景的菌株之一。构建黑曲霉高产菌种成为降低纤维素酶生产成本的 最有效途径之一。现在基因工程技术构建纤维素酶生产菌种一般通过基因敲除某个基因或 增强某个基因的表达。这些手段构建的基因工程菌种虽然产量有一定提高，但是产量提高 有限。原因基因工程敲除或强化表达的基因相对单一，纤维素酶产量的提高仅仅靠强化几 个基因的表达，产量提高有限。要进一步提高基因工程菌种，就需要在已有的操作目的基因 以外进行改造。 黑曲霉在诱导环境下下产生纤维素酶，基于二维电泳技术的技术能标识在两种诱 导剂诱导下胞外蛋白表达差异的种类，测定有差异蛋白的氨基酸序列，从而对表达有差异 的蛋白进行鉴定。这些差异蛋白的鉴定，能为基因工程技术的改造提供新的操作对象，为基 因工程菌株的构建提供一个新的改造目标基因。 黑曲霉由于胞壁坚韧，菌丝较长，必须有高效的破壁技术破除细胞壁，而且在细胞 壁破除时不破坏蛋白质的肽链。已有的蛋白破壁方法如：研磨破碎要破碎霉菌的细胞壁，所 需的巨大剪切力对菌体的蛋白损伤较大，而且破壁性能较差，因此很能使用与精确定量和 定性分析的目的；超声波破碎效果非常差，不适宜霉菌；用均浆机破碎时，具有破壁力大， 蛋白损伤或损失小的特点，但是由于霉菌的韧性较大，因此很难高效破碎，因此需要一定能 增加脆性的方法，使霉菌用均浆机破碎更高效。用低温冷冻液增加霉菌脆性，是一个新的有 效的提高破壁效率和蛋白提取率的方法。 同时由于黑曲霉的蛋白组成，不同于细菌、酵母菌，而且也显著不同于其他霉菌。 黑曲霉的蛋白种类繁多，而且一些蛋白的理化性质较为接近，已有的蛋白电泳技术不能非 常充分的分开黑曲霉的蛋白。因此必须有更高效的电泳方法来充分的分离各个蛋白质点。 同时在电泳时必须尽可能的把各个蛋白质点展开，这样才能高效的分析蛋白在表 达量和表达种类的差异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于破碎细胞壁的低温破壁液，该破壁液能够能增加 蛋白的提取率。本专利技术的目的还在于提供一种蛋白三向电泳方法。本专利技术的破壁液与电泳 方法能高效的提取黑曲霉的蛋白并充分分离各个蛋白质点。 一种用于破碎细胞壁的低温破壁液，其配制为：无水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸 5g，十六烷基吡啶0. 02g，十二烷基硫酸钠0. 03g，蒸馏水定容至IL;使用前在-20°C预冷 24h以上。 一种蛋白三向电泳方法，包括如下步骤： (1)制备蛋白电泳胶体：把塑料条用蒸馏水涂湿，放置在距制备胶体的盒子底部 靠近一端的位置，然后向盒子里面浇注SDS-PAGE胶体液至液体的高度达到l-2cm时候停止 浇注，放置一张醋酸纤维薄膜，继续浇注，每升高l_2cm就放置一张醋酸纤维薄膜，直到液 面达到5-lOcm高，待胶体凝固后取下塑料条，得到一个放置IPG胶条的凹槽。 所述的SDS-PAGE胶体液优选为：50mL的配方：蒸馏水13. 3mL，30 % Acr-Bis(29:l)16.7mL，lMTrispH8.819.0mL，10%SDS0.5mL，10%过硫酸铵 0.5mL。 (2)IPG胶条预处理：使用IPG干胶条在电泳平衡液I中浸泡24h以上。 所述的电泳平衡液I的配方优选为：50mmol/LTris_HCl，6mol/L尿素，30%甘油， 40g/LSDS，痕量溴酚蓝，使用前加入10g/LDTT。 (3)第一向电泳：将样品加入IPG胶条进行等电聚焦。 (4)第二、三向电泳：等电聚焦后的IPG胶条先后在平衡液I和平衡溶液中平衡后 转移到步骤（1)制备的胶体的凹槽内，再用SDS-PAGE胶体液密封IPG胶条进行第二向电 泳；第二向电泳结束后再进行第三向电泳。第二向电泳的方向与IPG胶条长边垂直，第三向 电泳的方向与第二向电泳的电泳面垂直。 所述的平衡溶液的配方优选为：50mmol/LTris-HCl，6mol/L尿素，30%甘油，40g/ LSDS，痕量溴酚蓝，25g/L碘乙酰胺。 (5)电泳后的胶体以醋酸纤维薄膜为支撑分成多片，再经过固定、染色和脱色处理 后进行扫描和质谱分析。 所述的低温破壁液或蛋白三向电泳方法在分析蛋白表达量和表达种类的差异中 的应用。 一种便于蛋白质谱高效分析黑曲霉表达量差异蛋白的蛋白提取和电泳方法，包括 如下步骤： (1)离心收集胞外蛋白：黑曲霉液体发酵的发酵液5000g离心收集菌丝，取4g菌 丝用IOmL蒸馏水反复冲洗6次，洗涤菌丝的液体和离心收集的液体混合，用来收集胞外蛋 白。 (2)低温高压泵破碎细胞提取胞内蛋白：取4g洗涤后的菌丝放入20mL预冷的上 述低温破壁液中再加入到高压均浆机里均浆破碎细胞。 (3)提取蛋白的浓缩和冷冻干燥：将步骤2)均浆破碎的细胞液和步骤1)的混合 蛋白液体混合均匀，加入10倍体积-20°c预冷的含100g/L三氯乙酸及0. 07%巯基乙醇的 丙酮溶液，并于-15°C静置过夜；然后50000g、4°C离心30min，弃上清；再加入-20°C预冷的 含0.07%巯基乙醇的丙酮溶液，-20°C静置2h，离心条件同上；重复上一步，立即离心，弃上 清；将沉淀冷冻干燥，干粉于_20°C放置备用。 (4)裂解和离心：称取干粉0. 15g，加入2mL裂解液，30°C水浴保温30min，然后 80000g、15°C离心lh，将上清液继续在80000g、10°C离心40min，所得上清液按照上述方法 进行蛋白三向电泳。 所述的裂解液的配方优选为：9.5mol/L尿素，20g/L3-丙磺酸内盐，l〇g/L二硫苏糖醇。 使用本专利技术的低温破壁液和三向的电泳方法，更有利于蛋白的提取和区分蛋白表 达的差异，特别适用于对黑曲霉蛋白的提取和蛋白表达差异的分析。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于破碎细胞壁的低温破壁液，其特征在于：每1L该低温破壁液的配制为：无水乙醇20g，三氯乙酸5g，醋酸5g，十六烷基吡啶0.02g，十二烷基硫酸钠0.03g，蒸馏水定容至1L。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42