一种具有免疫调节活性的磷酸化K5多糖的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有免疫调节活性的磷酸化K5多糖的制备方法。其以磷酸(H3PO4)、五氧化二磷(P2O5)、磷酸三乙酯(Et3PO4)为组合磷酸化试剂，在甲基磺酸(CH3SO3H)的作用下，在室温条件下完成K5多糖的磷酸化，并将制备得到的磷酸化K5多糖作用于小鼠巨噬细胞系(Raw264.7细胞)，发现其具有一定的免疫调节活性。

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫调节活性的磷酸化0多糖的制备方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种具有免疫调节活性的磷酸化1(5多糖的制备方法。
技术介绍
大量的研究表明多糖类化合物作为一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞没有毒副作用，而且炎症、老化、肿瘤细胞的增殖及转移、病原体感染等病理过程中都涉及糖链的参与，其抗肿瘤、抗病毒、抗凝血和免疫调节等生物活性已逐渐被临床应用。多糖类化合物不仅本身具有多种生物活性，其衍生物也具有独特的作用。如磷酸酯化、羧甲基化和羟乙基化以及硫酸化、乙酰化、磺酰化等，都可大大提高多糖或寡糖的生物活性。他匕也丨脑等发现卡拉胶和肝素等具有抑制疱疹病毒复制的作用，但其脱硫酸化产物则不具有上述活性#08111如等发现香菇多糖经硫酸酯化后具有显著的抗艾滋病毒作用。 作为肝素前体的大肠杆菌1(5荚膜多糖(1(59?为4-61^-1, 4-) 11的二糖重复单位(以』八代表葡萄糖醛酸而&代表乙酰氨基葡萄糖)，是动物体内肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。奶？3可以作为一种非动物来源性的前体化合物，经过硫酸化、异构化等修饰合成肝素和硫酸乙酰肝素，或两者的类似物。1(5多糖的硫酸化衍生物具有与肝素类似的生物学活性，在抗凝血、抗病毒、抗炎等方面发挥一定的作用。在糖的衍生物中，磷酸酯是一类比较重要的糖类衍生物，研究表明磷酸酯类衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫调节剂等生物活性，在糖基上引入磷酸根能使一些本无活性的糖类化合物具有活性，而1(5多糖磷酸酯类衍生物的制备及生物学活性研究尚未见报导。 【专利
技术实现思路
】 本专利技术的目的是提供一种具有免疫调节活性的磷酸化1(5多糖的制备方法。 本专利技术的技术方案为:以磷酸(^04)、五氧化二磷⑴从)、磷酸三乙酯(￡004)组合为磷酸化试剂，在甲基磺酸的作用下，在室温条件下完成1(5多糖的磷酸化。 本专利技术提出的具有免疫调节活性的磷酸化1(5多糖的制备方法的具体操作步骤如下:将一定量的脱乙酰化1(5多糖溶于中，磷酸化组合试剂比？04、？205和狀3？04按一定比例混合加入反应体系中，氮气保护状态下，室温反应3小时后，沉淀、透析得到磷酸化1(5多糖。将制得的磷酸化衍生物作用于小鼠巨噬细胞系￠-264.7细胞)，观察其免疫调节活性。 本专利技术的独到之处有两点:首先将成？04、？205和狀3？04按比例混合为磷酸化组合试剂，最大化的发挥磷酸化试剂的效用，从而得到磷酸化程度较高的衍生物；其次本专利技术对1(5多糖进行磷酸化修饰，表现出新的生物活性，可作为潜在的免疫调节增强剂进行开发应用。 【具体实施方式】 以下利用实施例进一步详细说明本专利技术，但不能认为是限定专利技术的范围。 实施例一 #5多糖的制备 将由本实验室保存的大肠杆菌1(5菌株的甘油冻存液100^ [接种于10此⑶培养基中，转速为20011)111，371恒温培养活化过夜。用火焰灭菌的接种环取菌液在⑶平板上划线分离单菌落，接种于⑶培养基中，转速为200印！11，371恒温培养至对数期。将得到的大肠杆菌1(5菌株种子液以5%的接种量接种于101⑶培养基(含有0.5%葡萄糖，0.5%。大豆油)中，转速为600印111，溶氧量30%，流加酸碱(2001/1肌30^-4)维持邱于7.4左右，371培养16-181！后停止发酵。将醇沉沉淀、透析得到的粗多糖脱蛋白后，经02八2琼脂糖凝胶柱、675葡聚糖凝胶柱纯化后得到精制1(5多糖。 实施例二:脱乙酰化1(5多糖的制备 将1(5多糖溶解于2001/1版10?中，于601脱乙酰反应18卜，反应结束后冷却至室温，用211101/1此1调节邱至9.0，防止脱乙酰化后1(5多糖由于氢键作用而沉淀，35000^截留透析袋透析，收集透析液冻干，即得脱乙酰化的1(5多糖。 实施例三:磷酸化1(5多糖的制备 将脱乙酰化1(5多糖溶解于20此0^803！1中，磁力搅拌溶解完全后加入20此呀04和20111113？04，然后在持续搅拌状态下逐步加入？205，最后形成氮气保护状态下的混合反应体系。在室温下反应3小时后，向反应体系中加入乙醚洗涤沉淀，再用丙酮、无水乙醇洗涤沉淀，然后再用超纯水作为透析液，截流分子量为3500的透析袋透析、冻干得到磷酸化1(5多糖。通过红外检测可知，1(5多糖磷酸化修饰后，12310^1出现强峰，为？ = 0的特征伸缩振动峰出现吸收峰，为？-0的伸缩振动峰，表明磷酸基团已与1(5多糖结合。测得磷酸化1(5多糖的取代度为1.02。 实施例四:磷酸化1(5多糖体外免疫调节作用 将磷酸化1(5多糖9 作用于尺冊264 7细胞，2处后&1688法和此法分别检测磷酸化1(5多糖刺激对巨噬细胞分泌勵和细胞因子I即-1 11-1的影响。结果显示磷酸化1(5多糖(5(^100^8/1110能显著促进巨噬细胞分泌勵、I即-￡1和11-1卩，具有一定的免疫调节活性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有免疫调节活性的磷酸化K5多糖的制备方法，是将一定量的脱乙酰化K5多糖溶于CH3SO3H中，磷酸化组合试剂H3PO4、P2O5和Et3PO4按一定比例混合加入反应体系中，室温反应3小时后，沉淀、透析得到磷酸化K5多糖，将制得的磷酸化衍生物作用于小鼠巨噬细胞系(Raw264.7细胞)，发现其具有一定的免疫调节活性。

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫调节活性的磷酸化K5多糖的制备方法，是将一定量的脱乙酰化Κ5多糖溶于ch3so3h中，磷酸化组合试剂h3po4、P205和Et3P04按一定比例混合加入反应体系中，室温反应3小时后，沉淀、透析得到磷酸化K5多糖，将制得的磷酸化衍生物作用于小鼠巨噬细胞系(Raw264.7细胞)，发现其具有一定的免疫调节活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:将lg脱乙酰化K5多糖溶解于20mLCH3SO3H中，磁力搅拌溶解完...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕丽萍，付海田，王敏，陈敬华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32