一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法与应用，以磁性纳米粒子为核心，用反相微乳液法对磁性核心进行包硅与氨基化修饰，在氨水催化作用下，水解TEOS和APTES，包被硅层的同时表面形成粗糙的网状结构，此结构表面携带大量的氨基基团，即为多氨基硅包磁性纳米粒子，可以用于非特异性以及特异性的DNA分离。本发明专利技术制备的多氨基硅包磁性纳米粒子原料成本低，制备方法操作简易、时间短，产物无毒，环境友好；与传统的先合成硅包磁性纳米粒子再氨基化制备的氨基硅包磁性纳米粒子相比，表面氨基数量极大提高，对DNA的分离率也大为提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于功能材料与检测分析领域，具体地涉及一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法与生物应用。
技术介绍
磁性纳米粒子因为独特的超顺磁性而广泛的应用于生物分离领域，例如，磁性纳米粒子标记抗体制备免疫磁珠分离目标细胞，标记小分子或者大分子物质(如甘露糖、万古霉素、适配体等)分离致病菌，标记与目标序列互补的寡核苷酸分离目标核酸序列，以及硅包磁性纳米粒子分离纯化基因组DNA等。DNA是生物体稳定的遗传物质，分子生物学技术可以准确可靠地通过特异性的靶标序列检测生物有机体(如致病菌、病毒、转基因食品等)的存在，但是有些检测目标物的残留限度非常之低，所以检测条件非常苛刻。例如基于分子杂交的目标核酸序列分离，如果目标残留片段非常有限，那么只有捕获序列大量存在的情况下，才可能捕获到痕量的目标序列。因此，磁性纳米粒子表面功能化基团的多少也直接关系到最终的检测灵敏度。在本专利技术中，我们制备了一种多氨基的硅包磁性纳米粒子，和普通的氨基化硅包磁性纳米粒子对比，表面带有粗糙的网状结构，携带有大量的氨基基团，不管是用这种多氨基硅包磁性纳米粒子直接非特异的吸附基因组DNA还是将目标序列进行寡核苷酸修饰通过杂交反应特异性的分离目标DNA序列，分离率都得到很大的提高，此外，氨基化修饰的纳米粒子也可以轻易地进行羧基化等改性，可以广泛应用于各种生物分离当中。在生物分离方面具有巨大的优势和潜力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对一些生物检测样品检测要求苛刻，增加磁性分离的分离能力，开发一种表面多氨基的硅包磁性纳米粒子，还提供了上述磁性纳米粒子非特异性和特异性的分离目标DNA的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了制备多氨基硅包磁性纳米粒子的方法，包括以下步骤：1)合成磁性纳米粒子；2)制备反相微乳液体系；3)硅包与氨基化修饰：将磁性纳米粒子加入反相微乳液体系，在氨水催化作用下，水解正硅酸四乙酯(TEOS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，包被硅层的同时表面形成粗糙的网状结构，此结构表面携带大量的氨基基团，即为多氨基硅包磁性纳米粒子。上述方法制备的多氨基硅包磁性纳米粒子可以用于非特异性以及特异性的DNA分离。步骤1)中合成的磁性纳米粒子可以是容易制备的铁氧体磁性纳米粒子，如Fe3O4、γ-Fe2O3，也可以是Fe-Co、Fe-Ni、Co-Ni等合金磁性纳米粒子，甚至是复杂的磁性复合物纳米粒子。但是，无论哪种磁性纳米粒子作为核心，均要求粒径均一，单分散性好，这样最终得到的产品才具有较高性能：较好的封闭磁性核心，具有较大的表面积并携带有大量的氨基基团。当所述磁性纳米粒子为Fe3O4时，可采用简易的共沉淀法合成磁性纳米粒子，具体步骤如下：将摩尔比2:1的Fe3+和Fe2+相互混合，在氮气氛围下剧烈搅拌，然后加热到60-90℃后快速注入氨水调节pH为9-12，继续反应20-30min，室温冷却，磁性收集Fe3O4磁性纳米粒子并用乙醇和水洗涤。优选地，为了使Fe3O4能够具有更好的单分散性，需要对其进行柠檬酸钠处理，具体步骤为，洗涤之后加入柠檬酸钠溶液，超声20-40min后磁性收集纳米粒子，然后重新加入新鲜的柠檬酸钠溶液中搅拌3-12h，再次磁性收集Fe3O4之后再用乙醇和水洗涤，最后进行干燥；其中所述柠檬酸钠溶液的优选浓度为0.5mol/L。步骤2)制备反相微乳液体系的具体方法为：将环己烷、正己醇、曲拉通X-100、水以14-16:3-4:3-4:1的体积比混合，搅拌辅以超声分散，将步骤1)中制备的磁性纳米粒子加入到混合液中，继续超声分散一段时间，然后搅拌3-12h，形成反相微乳液体系；当所述磁性纳米粒子为Fe3O4时，优选以0.15-1.2g/L的浓度加入混合液中。步骤3)硅包与氨基化修饰的具体操作方法为：向步骤2)形成的反相微乳液体系中加入氨水，搅拌20-40min后加入TEOS，搅拌反应3-24h后，加入APTES，继续反应3-24h，加入丙酮破乳，然后用乙醇和水洗涤多次，干燥待用。优选地，上述硅包与氨基化修饰操作方法中加入氨水的体积与反相微乳液体系的体积比为1:100-600；加入TEOS的体积与反相微乳液体系的体积比为1:60-200；加入APTES的体积与反相微乳液体系的体积比为1:100-1800。本专利技术还提供一种非特异性吸附目标生物体基因组DNA的方法，其步骤为：制备含有待检测DNA的缓冲体系，将多氨基硅包磁性纳米粒子加入到缓冲体系中，90-100℃下振荡混合10-120min，然后加入脱脂奶粉，在60℃下封闭10-30min，磁性分离，获得非特异性吸附有目标生物体基因组DNA的磁性分离物，磁性分离物用1×PCR缓冲液洗涤后可直接加入PCR体系中进行分析。优选地，所述含有待检测DNA的缓冲体系使用的缓冲液为pH＝9.0的TE缓冲液。优选地，加入脱脂奶粉的最终浓度为1％(w/v)。当加入的多氨基硅包磁性纳米粒子为Fe3O4磁性纳米粒子时优选的加入量为40-60μg/ml。本专利技术还提供一种特异性杂交分离目标DNA序列的方法，制备的多氨基磁性纳米粒子可以修饰寡核苷酸作为磁性探针通过杂交反应特异性的分离目标DNA序列，其步骤为：1)将多氨基硅包磁性纳米粒子通过偶联剂戊二醛与氨基化修饰并具有多聚T连接臂的寡核苷酸序列结合，结合物用脱脂奶粉溶液进行封闭，经洗涤后，磁性收集磁性分离探针；2)进行分离时，将磁性分离探针与目标分离序列在40-60℃混合30-120min(如目标分离序列为双链DNA需要预先热变性)，然后磁性分离。以上步骤分离的产物用1×PCR缓冲液洗涤后可直接加入PCR体系进行扩增。优选地，步骤1)中将多氨基硅包磁性纳米粒子通过偶联剂戊二醛与氨基化修饰并具有多聚T连接臂的寡核苷酸序列结合的具体操作为：将多氨基硅包磁性纳米粒子用TE缓冲液洗涤多次，然后将多氨基硅包磁性纳米粒子分散于含有戊二醛的TE缓冲液中，室温振荡2-4小时之后，用TE缓冲液洗去游离的戊二醛，然后分散到TE缓冲液中，加入氨基化修饰并具有多聚T连接臂的寡核苷酸，混合反应4-6小时。其中使用的TE缓冲液的pH优选为8.0，含有戊二醛的TE缓冲液中戊二醛的浓度优选为5％(w/v)。优选地，步骤1)中用脱脂奶粉进行封闭的脱脂奶粉的终浓度为1-10％(w/v)，温度为60℃，时间为10-30min。优选地，步骤1)中收集得的磁性分离探针可分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成磁性纳米粒子；2)制备反相微乳液体系；3)硅包与氨基化修饰：将磁性纳米粒子加入反相微乳液体系，在氨水催化作用下，水解TEOS和APTES，包被硅层的同时表面形成粗糙的网状结构，此结构表面携带大量的氨基基团，即为多氨基硅包磁性纳米粒子。

【技术特征摘要】
1.一种多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成磁性纳米粒子；
2)制备反相微乳液体系；
3)硅包与氨基化修饰：将磁性纳米粒子加入反相微乳液体系，在氨水催化作用
下，水解TEOS和APTES，包被硅层的同时表面形成粗糙的网状结构，此结构表
面携带大量的氨基基团，即为多氨基硅包磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，
步骤1)中所述磁性纳米粒子为铁氧体磁性纳米粒子、合金磁性纳米粒子或磁性
复合物纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，
步骤1)中所述磁性纳米粒子是铁氧体磁性纳米粒子，且步骤1)的具体操作为：
将摩尔比2:1的Fe3+和Fe2+相互混合，在氮气氛围下剧烈搅拌，然后加热到60-90℃
后快速注入氨水调节pH为9-12，继续反应20-30min，室温冷却，磁性收集Fe3O4磁性纳米粒子并用乙醇和水洗涤，再用柠檬酸钠溶液超声处理20-40min，然后
重新加入新鲜的柠檬酸钠溶液中搅拌3-12h，再次磁性收集Fe3O4之后再用乙醇和
水洗涤，最后进行干燥。
4.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，
步骤2)制备反相微乳液体系的具体方法为：将环己烷、正己醇、曲拉通X-100、
水以14-16:3-4:3-4:1的体积比混合，搅拌辅以超声分散，将步骤1)中制备的磁性纳
米粒子加入到混合液中，继续超声分散一段时间，然后搅拌3-12h，形成反相微乳
液体系。
5.根据权利要求1所述的多氨基硅包磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，
步骤3)硅包与氨基化修...

【专利技术属性】
技术研发人员：史贤明，白亚龙，施春雷，崔妍，王大鹏，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31