一种四氢嘧啶类化合物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种四氢嘧啶类化合物的制备方法，所述四氢嘧啶类化合物具有如式（Ⅴ）所示的通式：其中，R1=H，OH；R2=H，烷基，芳香基，杂环基。所述四氢嘧啶类化合物由云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensis var daliensis）CGMCC No.5912发酵获得，可应用于植物病毒性病害的防治，在农业上具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种四氢嘧啶类化合物的制备方法及其应用
本专利技术属于生物技术和植物保护领域，具体地说，是关于一种四氢嘧啶类化合物的制备方法及其在植物保护领域中的应用。
技术介绍
病毒病是对农作物危害严重并难以防治的顽固性病害，作物一旦感染上病毒病，将会出现花叶、小叶、嫩叶或植株出现条斑、果实畸形甚至全株枯死。病毒病害的传播、浸染和致害过程与细菌性病害和真菌性病害的表现有很大的区别。目前我国田间常见的病毒性病害主要有：水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病、烟草花叶病、蔬菜花叶病毒病、马铃薯花叶病毒病、番茄病毒病辣椒病毒病等。2010年，在我国南方多个省份发生了大面积的水稻黑条矮缩病，造成了粮食的严重减产。而目前国内外用于防治植物病毒性病害的药剂主要以无机化合物的铜制剂以及化学合成的核苷类化合物为主，如我国《农药登记公告》中的盐酸吗啉胍·乙酸铜、氯溴异氰尿酸、氨基寡糖素、三氮唑核苷·硫酸铜·硫酸锌、菌毒清、烯腺嘌呤·羟烯腺嘌呤·盐酸吗啉胍·硫酸锌·硫酸铜、混合脂肪酸·硫酸铜、盐酸吗啉胍等。在现有产品中，只有宁南霉素一种为生物农药。随着人们对环保意识的加强和对食品安全的重视，人们对生物农药需求的呼声越来越高。在生物农药中，微生物源农药是作用明确、环境友好的一类相对安全的农药，由于微生物具有生长周期短，代谢易于调控，可通过发酵实现大规模生产的特点，所以利用微生物发酵技术制备生物活性物质具有良好的工业化生产前景。
技术实现思路
本申请的专利技术人通过培养一种云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensisvardaliensis）CGMCCNo.5912（201210438796.X）后，进一步利用纯化手段，可得到四氢嘧啶类化合物，并首次发现本专利技术的四氢嘧啶类化合物对于烟草花叶病毒具有较好的抑制作用，可用于植物病毒性病害的防治。因此，本专利技术的一个目的在于提供四氢嘧啶类化合物的制备方法。本专利技术的另一个目的在于提供所述四氢嘧啶类化合物用于植物病毒性病害的防治的应用。本专利技术提供了一种四氢嘧啶类化合物的制备方法，由云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensisvardaliensis）CGMCCNo.5912发酵获得，其中，所述四氢嘧啶类化合物具有如式（Ⅴ）所示的通式：其中，R1=H，OH；R2=H，烷基，芳香基，杂环基。根据本专利技术的优选实施例，所述发酵的发酵培养条件为：发酵温度26～30℃，发酵时间4～5天；发酵培养基：花生饼粉3%，淀粉1%，可溶淀粉1.5%，玉米面1%，葡萄糖0.5%，酵母粉0.1%，食盐0.3%，碳酸钙0.3%，硫酸铵0.25%，磷酸二氢钾0.025%，硫酸镁0.0025%，pH7.0。根据本专利技术，所述制备方法还包括将发酵液经阳离子交换树脂、分子筛和高压液相色谱分离精制的步骤。本专利技术还提供了所述四氢嘧啶类化合物的应用，用于植物病毒性病害的防治，其中，所述四氢嘧啶类化合物具有如式（Ⅴ）所示的通式：其中，R1=H，OH；R2=H，烷基，芳香基，杂环基。根据本专利技术，所述植物病毒性病害为烟草花叶病毒。根据本专利技术，所述四氢嘧啶类化合物可为单独或组合使用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种通过培养发酵云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensisvardaliensis）CGMCCNo.5912来制备四氢嘧啶类化合物的方法，利用微生物发酵技术制备生物活性物质具有良好的工业化生产前景，并且发现本专利技术的四氢嘧啶类化合物对于烟草花叶病毒具有较好的抑制作用，可用于植物病毒性病害的防治，在农业上具有广泛的应用前景。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。本专利技术的云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensisvardaliensis）是通过采土分离微生物的方法获得的，其菌株已于2012年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号：CGMCCNo.5912。实施例1、菌株的培养将生长于燕麦培养基斜面的云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensisvardaliensis）CGMCCNo.5912菌种接种于发酵培养基中，在28℃下培养30小时。再以此培养物为种子，以10%的比例接种于发酵培养基中，于28℃下通气搅拌培养100小时。其中，所述燕麦培养基的配方如下：燕麦片6%，琼脂1.4%。将60g燕麦片加入600ml水中，加热至45-50℃，制成匀浆；14g琼脂加入另400ml水中，加热至熔融。将两者混合后121℃灭菌后制成燕麦培养基斜面备用。所述发酵培养基的配方如下：花生饼粉3%，淀粉1%，可溶淀粉1.5%，玉米面1%，葡萄糖0.5%，酵母粉0.1%，食盐0.3%，碳酸钙0.3%，硫酸铵0.25%，磷酸二氢钾0.025%，硫酸镁0.0025%，pH7.0。本实施例中所述发酵培养基配方中的营养源并无特殊的要求，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。其中，碳源可以为该菌株可利用碳源中的一种或多种，包括：葡萄糖、甘露糖、甘露醇、L-阿拉伯糖、山梨醇、蜜二糖、海藻糖、果糖、木糖、核糖、水杨苷、苦杏仁苷、纤维二糖、赤藓醇、丙酸钠、甘油、淀粉、乙酸钠、苹果酸钠、琥珀酸钠、丙二酸钠；氮源可为肉胨、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母、肉膏、玉米浆、棉籽粉、尿素、铵盐、硝酸盐等其他有机或无机含氮化合物；其他营养源则可添加一些无机盐类，例如食盐、磷酸盐以及钾、钙、镁、铁、锰等金属盐，必要时还可添加一些动植物、矿物油等作为消泡剂。该菌株的发酵对培养基的温度、pH、时间等条件并无严格限制。发酵液中的活性组分越高，越有利于菌株的生产，试验表明，在如下条件下，活性组分产量较高：葡萄糖占3%、淀粉占2%左右；培养基的pH范围为6～8，以接近中性为好；培养温度在20～35℃；通气比在1：0.2～1：3之间（通气比：每分钟通过培养液的空气体积与培养液体积之比）。上述培养基的组份、pH、培养温度、通气条件等还应根据实际情况进行适当调整，以获得最好的效果。实施例2、发酵液的纯化按照实施例1所述的方法，将云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensisvardaliensis）CGMCCNo.5912菌种于26～30℃下发酵培养4～5天后，采用常规过滤或离心的手段将菌丝体和发酵液分开，取发酵液进一步纯化。一般流程是先将发酵液通过阳离子交换树脂，洗脱收集活性组分再经过分子筛进一步纯化即可得到本专利技术的几个化合物的混合物。如需进一步纯化单个化合物，则可采用高压液相色谱分离技术获得。具体来说，先将731型阳离子交换树脂装柱预处理（预处理过程：用2～3倍体积的1M盐酸洗涤，用去离子水洗涤至中性；再以2～3倍体积的1M氢氧化钠洗涤，用去离子水洗涤至中性；如此反复二次；最后一次用1M氨水洗涤，再用去离子水洗涤至中性后备用）。然后将发酵上清液通过预处理好的阳离子交换树脂，体积比可以是1：1～2：1，使活性物质吸附于树脂上。先用去离子水洗涤，水用量可以是树脂的2～4倍体积，此过程中无活性物质流出。然后用1.5～2倍柱体积的氯化钠水溶液（浓度范围为0.05～0.2M，优选0.1M）进一步洗涤以除去杂质。最后用3～5倍柱体积的更高浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
四氢嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，由云南链霉菌大理变种（S.Yunnanensis var daliensis）CGMCC No.5912发酵获得，其中，所述四氢嘧啶类化合物具有如式（Ⅴ）所示的通式：其中，R1=H，OH；R2=H，烷基，芳香基，杂环基。

【技术特征摘要】
1.四氢嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，由云南链霉菌大理变种(S.Yunnanensisvardaliensis)CGMCCNo.5912发酵获得，其中，所述四氢嘧啶类化合物具有如式(Ⅴ)所示的通式：其中，R1＝H，OH；R2＝H，烷基，芳香基，杂环基；且所述通式(V)所示的四氢嘧啶类化合物选自以下四种化合物：2-甲基-4-羧基-5-羟基-3,4,5,6-四氢嘧啶；2-甲基-4-羧基-3,4,5,6-四氢嘧啶；2-甲基-4-甲酸甲酯基-5-羟基-3,4,5,6-四氢嘧啶；以及2-甲基-4-甲酸甲酯基-3,4,5,6-四氢嘧啶。2.如权利要求1所述的四氢嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，所述发酵的发...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶黎明，徐晓庆，陈家任，徐文平，王玉亭，
申请(专利权)人：威海韩孚生化药业有限公司，乳山韩威生物科技有限公司，陶黎明，陈家任，
类型：发明
国别省市：山东;37