一种金刚烷胺人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种金刚烷胺人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。金刚烷胺人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ)，金刚烷胺人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。所述应用是所述金刚烷胺人工抗原在制备抗金刚烷胺抗体中的应用。本发明专利技术的金刚烷胺人工半抗原最大程度地保留了金刚烷胺的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的金刚烷胺人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗金刚烷胺抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1:70000，可用于对金刚烷胺进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种金刚烷胺人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
金刚烷胺可以抑制病毒穿入宿主细胞，并影响病毒的脱壳，抑制其繁殖，在临床上用于预防和治疗人流感病毒的感染，具有价格低廉、药效明显等特点，同时也曾是帕金森综合症的治疗药物。但金刚烷胺蓄积会对人体造成嗜睡、失眠、眩晕、抑郁、恶心、食欲减退等多种不良反应，具有一定的毒副作用。长期使用金刚烷胺还可使病毒产生不同程度的耐药性，诱导产生新型耐药病毒。然而，2012年11月媒体曝出国内养殖的“速生鸡”从孵出到端上餐桌只需45天，不法商贩为了保证其存活，给鸡喂养了大剂量人用药物来抑制禽类的禽流感等病症。2012年12月，央视调查中称，一些养殖户为进一步缩短养殖周期，让原本已经是速成品种的白羽鸡长得更快，偷偷喂食违禁药物，其中包括金刚烷胺等抗病毒药品和地塞米松等激素类药品。“速成鸡”事件的爆发引发了全国消费者对禽肉食品安全的广泛关注和担忧，对建立快速、灵敏、准确的检测技术提出了迫切需求。目前，对金刚烷胺的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括金刚烷胺在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。现有技术中还未有金刚烷胺人工半抗原、人工抗原的相关报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种金刚烷胺人工半抗原，该金刚烷胺人工半抗原最大程度地保留了金刚烷胺的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。一种金刚烷胺人工半抗原，其分子结构式如(Ⅰ)所示：本专利技术还提供了该金刚烷胺人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)将金刚烷胺与丁二酸酐按摩尔比1:1.1～1.5混合，于100～105℃下搅拌反应16～17h，反应产物经水-二氯甲烷萃取，取有机相，得无色油状产物A；在该反应条件下，无色油状产物A的得率较高，后处理程序较为简单，较易提纯。步骤(1)的反应可在吡啶中进行。(2)将无色油状产物A、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1:1.35～1.5:1.35～1.5混合，于20～30℃下搅拌反应18～20h，反应产物经洗涤、旋蒸后，得无色油状产物B；在该反应条件下，无色油状产物B的得率较高，后处理程序较为简单，较易提纯。步骤(2)的反应可在二氯甲烷中进行。优选地，反应产物依次用0.1mol/L盐酸水溶液、双蒸水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。采用如上酸洗、水洗、碱洗、再盐洗的程序可以除去反应体系中偏碱，偏酸的副产物或者杂质，以达到大致提纯的目的。(3)将无色油状产物B与对氨基苯甲酸按摩尔比1:1混合，于pH9～10、20～30℃下搅拌反应3～3.5h，反应结束后调节pH至5～6、用乙酸乙酯萃取，取有机相，获得所述的金刚烷胺人工半抗原。优选地，先将无色油状产物B溶于四氢呋喃中，得到产物B溶液；将等摩尔量的对氨基苯甲酸溶于四氢呋喃与双蒸水的混合液中，得到对氨基苯甲酸溶液，然后将对氨基苯甲酸溶液滴加到产物B溶液中，混合。更优选地，四氢呋喃与双蒸水的混合液中，四氢呋喃与双蒸水的体积比为2～4:1，最优选为2:1。通过上述方法，在金刚烷胺的N位上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留金刚烷胺的特征结构。与采用一般的饱和链烃作为连接臂相比，本专利技术所采用的连接臂中含有苯环结构，可使人工半抗原的特异性增强，在溶液中保持构象稳定，提高所形成的人工抗原(II)的免疫特性。本专利技术还提供了一种金刚烷胺人工抗原，其分子结构式如(Ⅱ)所示：式(Ⅱ)中，BGG为牛丙种球蛋白。本专利技术还提供了一种所述金刚烷胺人工抗原的制备方法，包括：通过混合酸酐法或N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法使所述金刚烷胺人工半抗原与牛丙种球蛋白结合，获得所述金刚烷胺人工抗原。具体地，采用混合酸酐法制备金刚烷胺人工抗原时，包括以下步骤：(a)将所述金刚烷胺人工半抗原、三乙胺、氯甲酸异丁酯按摩尔比1:1～1.2:1～1.3混合20～30℃下搅拌反应18～19h，反应结束后离心取上清液；(b)将所述上清液滴加到牛丙种蛋白溶液中，将所得混合液置于3～5℃下静置过夜，经透析、离心取上清，获得所述的金刚烷胺人工抗原。如未作特殊说明，本专利技术中所述牛丙种蛋白溶液是将牛丙种蛋白溶于钠离子浓度为0.1～0.2mol/L的PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)中制成的。步骤(b)中，所述牛丙种蛋白溶液的浓度为5mg/mL，上清液与牛丙种蛋白溶液的体积比为1:5～6。本专利技术选用牛丙种球蛋白(BGG)作为大分子载体，与牛血清蛋白(BSA)相比具有以下优点：①牛丙种球蛋白能够结合更多的金刚烷胺人工半抗原，免疫原性较好；②从实验看，牛丙种球蛋白与金刚烷胺人工半抗原的结合更稳定，牛血清蛋白与金刚烷胺人工半抗原结合后，金刚烷胺人工半抗原容易在后续处理中脱离，从而使最终的人工抗原在长期保存中容易产生沉淀，稳定性差；③用牛丙种球蛋白与金刚烷胺人工半抗原结合后形成的金刚烷胺人工抗原，经动物免疫得到的抗金刚烷胺抗体的特异性更好。本专利技术还提供了所述金刚烷胺人工抗原在制备抗金刚烷胺抗体中的应用。本专利技术还提供了一种抗金刚烷胺抗体，是由所述金刚烷胺人工抗原经动物免疫得到的、可与金刚烷胺发生特异性免疫反应的球蛋白。本专利技术还提供了所述抗金刚烷胺抗体在检测金刚烷胺中的应用。试验发现，将所述金刚烷胺人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1:70000。表明本专利技术的金刚烷胺人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金刚烷胺人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅰ)所示：

【技术特征摘要】
1.一种金刚烷胺人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅰ)
所示：
2.如权利要求1所述金刚烷胺人工半抗原的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
(1)将金刚烷胺与丁二酸酐按摩尔比1:1.1～1.5混合，于100～105℃
下搅拌反应16～17h，反应产物经水-二氯甲烷萃取，取有机相，得无色油
状产物A；
(2)将无色油状产物A、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-
乙基碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1:1.35～1.5:1.35～1.5混合，于20～30℃下搅
拌反应18～20h，反应产物经洗涤、旋蒸后，得无色油状产物B；
(3)将无色油状产物B与对氨基苯甲酸按摩尔比1:1混合，于pH
9～10、20～30℃下搅拌反应3～3.5h，反应结束后调节pH至5～6、用乙酸乙
酯萃取，取有机相，获得如权利要求1所述的金刚烷胺人工半抗原。
3.一种金刚烷胺人工抗原，其特征在于，其分子结构式如(Ⅱ)所
示：
式(Ⅱ)中，BGG为牛丙种球蛋白。
4.如权利要求3所述金刚烷胺人工抗原的制备方法，其特征在于，
包括：通过混...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨华，邵越水，张巧艳，钱鸣蓉，汪建妹，吴俐勤，肖英平，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，杭州傲锐生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33