一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法。所述复合菌剂是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌分别发酵培养后混合得到的发酵混合液。所述的复合菌剂突破细菌产胞外酶活低，真菌分解速率慢的局限，以农业废弃物-秸秆为发酵底物，采用固态发酵工艺，制备高附加值生物酶制剂，简便易行，成本低廉且可变废为宝，所得纤维素复合酶对纤维素底物的降解性能较强，为分解秸秆产纤维素酶提供关键技术，在秸秆发酵饲料及饲用酶制剂领域将有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种复合菌剂及其制产纤维素酶的方法，属于农业发酵

技术介绍
随着畜牧业的迅猛发展，如何提高粗饲料的营养价值并增加其瘤胃消化率已成为全球研究的热点。近年来，青贮或日粮中添加纤维素酶制剂引起了人们的广泛关注，然而受各种因素的影响，如酶的生产成本、种类和添加量、酶的反应条件等，其推广使用尚存在一些限制。对于纤维素酶的生产菌株，以往的研究多集中在纯化菌，但在以秸秆等天然木质纤维素材料为底物时，纯化菌株定植缓慢，产酶效率低。近年来研究发现在发酵过程中将微生物共培养能够增加纤维素酶的量，筛选构建复合系对木质纤维素进行降解和生产纤维素酶成为研究热点。另外，现有的酶制剂生产工艺包括液态发酵(Submerged Fermentation，SmF)和固态发酵(Solid-state Fermentation，SSF)。但液态发酵存在木质纤维素材料的降解难度大，转化成本高的缺陷，因此固态发酵产酶成为具有应用前景的技术手段。然而现有生产纤维素酶的方法存在效率低、成本高的缺陷，远没有满足实际生产需求，因此需要寻找一种高效的产酶菌、产酶工艺和廉价的发酵底物。
技术实现思路
本专利技术第一目的是提供一种复合菌剂，以秸秆为底物，对其进行固态发酵生产木质纤维素酶，所得纤维素酶的活力高，提高了产酶效率，降低了酶的生产成本，同时也增加了秸秆的利用率，为秸秆等农业废弃物的利用及非常规饲料的开发和应用提供了新途径。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种复合菌剂，是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌分别接种于培养基，发酵培养后将发酵液混合得到的发酵混合液；其中所述发酵混合液中缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌的菌落形成单位数目比为20-25：15-20：15-20：40-50，菌落形成单位数目为0.8×106-1.2×106CFU。其中，所述缓纤维梭菌(Clostridium lentocellum)，其保藏编号为ATCC 49066。所述解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)，其保藏编号为DSM 18836。所述噬细胞菌(Cytophaga sp.)，其保藏编号为ATCC13125。所述灰盖鬼伞菌(Coprinus cinereus)，其保藏编号为CGMCC NO.4051。所述培养基为Mandels培养基，其配方如下：同时在培养基中添加小麦秸秆作为唯一的碳源，长度为2-3cm，添加量为前述培养基总质量的1％。所述发酵培养条件为：33-37℃静止培养7d。上述复合菌剂还可制成本领域常用固体剂型，所述固体复合菌剂是由上述发酵混合液与载体按0.8×106-1.2×106CFU：(1－10)g比例配制而得；优选地，所得发酵混合液与载体按1×106CFU：5g比例配制。所述载体为麦饭石和/或秸秆粉。本专利技术的另一个目的是提供一种高效低廉制产纤维素酶的方法，是以秸秆为底物，将复合菌剂接种到培养基中进行固态发酵培养，得到纤维素复合酶。所述纤维素复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。所述方法具体步骤如下：1)将秸秆粉碎与培养基混合，115-120℃灭菌15-30min，冷却；2)将上述复合菌剂接种到步骤1)所得体系中，每天搅拌一次，30-35℃培养7-10天，将发酵产物真空干燥，得到固态纤维素复合酶。其中，所述秸秆为水稻、小麦、玉米或其它木质纤维素材料，长度＜1mm。所述培养基配方为(g/l)：所述秸秆与培养基混合比例为5-10:15-20(g/ml)，优选10：15(g/ml)。所述复合菌剂添加量为每千克培养基中菌落形成单位数目为0.16×106-0.24×106CFU。本专利技术所述的复合菌剂突破细菌产胞外酶活低，真菌分解速率慢的局限，以农业废弃物-秸秆为发酵底物，采用固态发酵工艺，制备高附加值生物酶制剂，简便易行，成本低廉且可变废为宝，所得纤维素复合酶对纤维素底物的降解性能较强，为分解秸秆产纤维素酶提供关键技术，在秸秆发酵饲料及饲用酶制剂领域将有广阔的应用前景。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1 一种复合菌剂Ⅰ由如下方法制得：将缓纤维梭菌、木聚糖拟杆菌、噬细胞菌、灰盖鬼伞菌分别接种于Mandels培养基中，35℃静止培养7d，发酵培养产物分别为A、B、C、D，混合均匀得到复合菌系培养物。其中，以CFU计，缓纤维梭菌：解木聚糖拟杆菌：噬纤维菌：灰盖鬼伞菌的比例为25：20：15：40。所述Mandels培养基的成分为：并在培养基中添加小麦秸秆作为唯一的碳源，2cm长，添加量为前述培养基总质量的1％。实施例2 一种复合菌剂Ⅱ采用实施例1的方法制备，区别在于，复合菌系培养物中缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌的菌落形成单位数目比为25：15：15：45。实施例3 一种复合菌剂Ⅲ采用实施例1的方法制备，区别在于，复合菌系培养物中缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌的菌落形成单位数目比为20：15：15：50。实施例4 一种固体型复合菌剂将实施例1所得复合菌剂与麦饭石按1.0×106CFU：5g吸附载体，即得。实施例5 一种固体型复合菌剂将实施例2所得复合菌剂与麦饭石按1.0×106CFU：1g吸附载体，即得。实施例6 一种固体型复合菌剂将实施例3所得复合菌剂与麦饭石按1.0×106CFU：10g吸附载体，即得。实施例7 一种利用复合菌剂制产纤维素复合酶的方法包括如下步骤：1)将水稻秸秆粉碎至长度<1mm，与培养基按10g：15ml比例混合，118℃灭菌20min，冷却；2)将实施例1所得复合菌剂Ⅰ接种到步骤1)所得体系中，每天搅拌一次，30-35℃培养7-10天，将所得发酵产物45℃真空干燥至水分的重量含量在8.0％以下，得到固态纤维素复合酶。其中，所述水稻可替换为小麦、玉米或其它木质纤维素材料。所述培养基配方为(g/l)：所述秸秆与培养基混合比例为10:15(g/ml)。所述复合菌剂添加量为每千克培养基中菌落形成单位数目为0.2×106CFU。采用相同的方法，利用实施例2复合菌剂II、实施例3复合菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合菌剂，其特征在于，是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌分别接种于培养基，发酵培养后将发酵液混合得到的发酵混合液；其中所述发酵混合液中缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌的菌落形成单位数目比为20‑25：15‑20：15‑20：40‑50，菌落形成单位数目为0.8×106‑1.2×106CFU；所述发酵培养条件为：33‑37℃静止培养7d。

【技术特征摘要】
1.一种复合菌剂，其特征在于，是由缓纤维梭菌、解木聚糖拟
杆菌、噬纤维菌、灰盖鬼伞菌分别接种于培养基，发酵培养后将发
酵液混合得到的发酵混合液；
其中所述发酵混合液中缓纤维梭菌、解木聚糖拟杆菌、噬纤维
菌、灰盖鬼伞菌的菌落形成单位数目比为20-25：15-20：15-20：40-50，
菌落形成单位数目为0.8×106-1.2×106CFU；
所述发酵培养条件为：33-37℃静止培养7d。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述缓纤维梭
菌(Clostridium lentocellum)，其保藏编号为ATCC 49066；
所述解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)，其保藏编号为
DSM 18836；
所述噬细胞菌(Cytophaga sp.)，其保藏编号为ATCC13125；
所述灰盖鬼伞菌(Coprinus cinereus)，其保藏编号为CGMCC 
NO.4051。
3.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述培养基
为Mandels培养基，其配方如下：
同时在培养基中添加小麦秸秆作为唯一的碳源，长度为2-3cm，
添加量为前述培养基总质量的1％。
4.根据权利要求1-3任一所述的复合菌剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小芬，崔宗均，刘晶晶，王小娟，袁旭峰，朱万斌，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11