本发明专利技术涉及一种调节基因表达的非编码核酸，更具体的涉及miRNA‑200b在制备β‑catenin抑制剂的新用途。发明专利技术分别在缺氧缺血性脑损伤组织中过表达和低表达miR‑200b，检测期间β‑catenin蛋白表达情况，结果显示过表达miR‑200b后，β‑catenin蛋白表达降低，与此同时低表达miR‑200b后，β‑catenin蛋白表达升高，说明miR‑200b通过调控β‑catenin蛋白表达参与缺氧缺血性脑损伤的修复过程。本发明专利技术提供了miR‑200b的新应用，其在缺氧缺血性脑损伤组织中可以有效的调节β‑catenin蛋白表达，对缺氧缺血性脑损伤的修复具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种调节基因表达的非编码核酸，更具体的涉及miR-200b的新用途。
技术介绍
microRNAs(miRNAs)是近年来研究发现的一类长度约22-24个核苷酸的非编码小分子RNA，是非编码小RNA(non-coding small RNA)家族中迄今研究最多的成员。目前认为miRNA主要通过以下两方面的机制介导转录后基因调节：mRNA的降解和翻译抑制。具体哪种作用方式取决于miRNA和靶mRNA互补配对的程度。miRNA能调控多种生物学过程，包括细胞周期、凋亡、分化发育和新陈代谢等，它在疾病发病和进展中所显现的治疗潜力已引起人们极大的兴趣。越来越多的证据表明，以miRNA为基础的基因治疗，不管是增强或抑制miRNA的表达和活性，都有很大的应用前景。尽管miRNA的生物合成和具体机制还有许多有待我们去探索，但已有足够的证据表明miRNAs在不同组织和疾病的表达存在差异。通过研究人类疾病中一些miRNA的异常表达，比如癌症，中枢神经系统疾病，感染性疾病，心血管疾病，代谢性疾病，和自身免疫性疾病，可以帮助我们开发新的基因治疗途径。 miR-200家族是由两个簇的五个成员：miRs-200b/c/429和miRs-200a/141组成的。在人类miR-200家族定位在l号和12号染色体上，在小鼠类定位在4号和6号染色体上。miR-200家族中的五个成员拥有高度相似的种子序列，miRs-200b/c/429的种子序列为AAUCU，miRs-200a/141的种子序列为AACACU。目前对miR-200家族的研究主要集中在miR-200家族在上皮间质转化转化和恶性肿瘤转移中的作用。 本专利技术旨在研究miR-200b在缺氧缺血性脑损伤的组织中与β-catenin的关系。专利技术首先建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，进行相应组的miRNA激动剂或 拮抗剂转染，分别过表达和低表达miR-200b，于不同时间点取大鼠脑组织检测β-catenin蛋白的变化趋势，从而了解miR-200b对β-catenin的作用。结果显示转染miR-200b后，β-catenin蛋白表达降低，拮抗miR-200b后，β-catenin蛋白表达进一步升高，说明miR-200b可能通过介导β-catenin参与缺氧缺血性脑损伤的修复作用。本专利技术提供了miR-200b的新应用，即miR-200b在缺氧缺血性脑损伤组织中可以有效的调节β-catenin蛋白的表达，这对缺氧缺血性脑损伤组织修复具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供miRNA-200b在制备β-catenin蛋白表达抑制剂中的应用。 所述miRNA-200b成熟序列为mmu-mir-200b-3p(miRBase登录号为MIMAT0000233)。 术语―miRNA‖(微小RNA)是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于，内源微小RNA和人工微小RNA。内源miRNA是在基因组中天然存在的小RNAs，其能够调节mRNA的生产利用。术语―人工的‖或―合成的‖miRNA包括除内源miRNA之外的任何类型的RNA序列，其能够调节mRNA的生产利用。 本专利技术中miRNA-200b、miR-200b、microRNA-200b属于同一物质的不同表达形式，所代表的意思相同。 进一步，所述的miRNA可以经化学修饰的合成RNA。所述的化学修饰包括糖基修饰、磷酸链修饰、碱基修饰、突出和末端修饰、双螺旋结构修饰等。 核糖上的修饰最为广泛，因为2’-OH不是活性siRNA所必需的。RNA的2’-O甲基化可以提高结合亲和力和抗核酸酶的稳定性，并且在双螺旋中有很好的相容性，这些优点使其成为应用最为广泛的修饰之一。2’-O-甲氧乙基修饰已经用于一个siRNA的3’端突出和正义链上，但不适用于反义链。2’-O-烯丙基修饰除了可以应用在3’端突出外，其他大部分位点修饰都会引起活性降低。siRNA双链上70％的2’-OH被随机替换为2，4-二硝基苯基醚可以改善其诸多性质，如高亲和性、抗核酸酶稳定性和效价。 2’-F-RNA在正义链和反义链上的部分取代都是可以耐受的，有些全取代的siRNA同样具有活性。此外，2’-F-RNA修饰还大大提高siRNA的血浆稳定性， 改善双螺旋的结合亲和性。改变2’-F-RNA的氟原子的立体化学得到2’-F-ANA，它在siRNA双螺旋中也有很好的耐受性，包括对正义链的全修饰和反义链的部分修饰，它的引入也带来高亲和性和抗核酸酶稳定性。 DNA本身也是一种修饰，在它的2’-位没有电负性取代基，这种修饰同样可以被siRNA双螺旋所接受，在3’-突出端，或者碱基配对区域。全部用DNA嘌呤和2’-F-RNA嘧啶修饰的反义链有沉默活性。对反义链5’端的8个碱基区域用dsDNA进行替换有沉默活性，并可降低脱靶效应。 糖环氧也可修饰，4’S-RNA具有高亲和性，而且对核酸酶的稳定性大大提高。它在siRNA双螺旋末端有很好的耐受性。在2条链末端用4’S-RNA和2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基组合修饰显示出很好的效果和血浆稳定性。对2’-和4’-位进行修饰的4’S-FANA插入到2条链的各个位置也显示出siRNA活性。但它的较低亲和性只允许少量插入双螺旋。 LNA修饰同样也应用于siRNA修饰，其构象的刚性特点显著增强了其亲和性。在siRNA上小心引入此种修饰可得到多种类型的功能双螺旋。最常用于修饰的位点是正义链的末端和反义链的3’-突出端。 磷酸链的几种变化也可被RNAi机制接受。硫代磷酸酯键(PS)修饰后与未修饰的siRNA相比，效价相当或有所降低。是否可以全部进行PS修饰依赖于链的结构。已经观察到大量PS修饰后的细胞毒性。但PS修饰对siRNA的生物分布似乎没有明显影响。 硼烷磷酸酯键修饰的siRNA有基因沉默活性，与PS修饰和未修饰的siRNA相比可提高沉默效能。但为了达到最大效能，反义链中心区不宜修饰。这种修饰能显著提高siRNA的抗核酸酶稳定性。 核苷酸的2’，5’连接方式(2’，5’-DNA，或2’，5’-RNA)可以替换3’，5’连接方式，但只适用于正义链，并且会导致部分活性丧失。非离子性的酰胺键已经应用在siRNA的3’-突出端。 碱基修饰。siRNA的碱基修饰更受限制，能稳定A-U碱基配对(5-Br-尿嘧啶和5-I-尿嘧啶代替尿嘧啶，二氨基嘌呤代替腺嘌呤)的修饰可被siRNA接受，但是这种改造会导致活性有所降低。4-硫脲嘧啶修饰已有应用。2-硫脲嘧啶和C-连接的伪尿嘧啶可以提高亲和性，并且可以提高效价和特异性，前提是在双螺旋的合适位置引入。嘧啶的5-甲基化(使用T和5-Me-C代替U和C)常常和糖环的 修饰如DNA，2’-F-ANA和LNA修饰联用。 一些非标准的碱基结构也用于siRNA中。例如二氟代苯基，它与胸腺嘧啶形状相同但不能形成氢键，可以在整个siRNA双螺旋结构中代替某个位置的尿嘧啶碱基，而不会大幅度降低效价或者改变裂解机制。非芳香性的二氢本文档来自技高网...
【技术保护点】
miRNA‑200b在制备β‑catenin蛋白表达抑制剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.miRNA-200b在制备β-catenin蛋白表达抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA为经化学修饰的RNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的化学修饰包括糖基修饰、
磷酸链修饰、碱基修饰、突出和末端修饰、双螺旋结构修饰中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自pri-miRNA、
pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或变体中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA与药学上可接受的载
体或赋形剂组合制备β-catenin蛋白表达抑制剂。
6.一种抑制β-catenin蛋白表达的方法，包括：
1)制备miRNA-200b模拟物；
2)将上步制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔红，杨爱君，马东青，杨丽君，朱琳涵，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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