本发明专利技术公开了一种快速检测化脓性链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：BeaconSPY：5’-CY3-CATTGTACGCCCATAATTCGGACCAATG–BHQ1-3’；所述探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm。本发明专利技术的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测化脓性链球菌。本发明专利技术还公开了一种快速检测化脓性链球菌的试剂盒及检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种分子信标探针和试剂盒，通过使用荧 光原位杂交的手段，检测样品中少量的化脓性链球菌。
技术介绍
化脓性链球菌又称A组链球菌（GAS)，是人类细菌感染中最重要的病原之一。化 脓性链球菌可侵及人体的任何部位，但以上呼吸道、其次皮肤软组织感染为最常见的原发 感染部位。化脓性链球菌可引起化脓性疾病及非化脓性并发症两类疾病。由化脓性链球菌 间接所致的非化脓性并发症即免疫性疾病：风湿热和急性肾小球肾炎。化脓性链球菌亚型 多，各型间无交叉免疫，故常反复感染。近年来由化脓性链球菌所引起的严重感染，侵袭性 化脓性链球菌感染发病率的增长及其所致严重后果，也引起了人们对该类细菌感染更大的 关注。 目前临床上检测化脓性链球菌最常用的方法是涂片检测法，据不同疾病采取不同 的标本。如伤口的脓液，咽喉、鼻腔等病灶的棉拭，败血症时取血液等。检测抗体时取血清。 直接涂片镜检脓液标本可直接涂片，革兰染色后镜检。脓液标本镜下观察时，细菌常呈双或 以单个形式存在，而不是呈典型的链状。该方法具有简单、快速、成本低的优点，缺点是灵敏 度低，痰内或者其它标本内含菌量少时往往不能得出阳性结果。 分离培养法的结果相对可靠，特异性高，是目前诊断化脓性链球菌感染的金标准。 但化脓性链球菌不能在普通琼脂平板及肉汤培养基中培养，需要在培养基中加入血液方能 生长，有时还需要在培养基中加入多种生长因子，且需要3-5天才能看到检测结果。由此可 见，化脓性链球菌的临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。 分子信标探针（Molecular beacon probe)，具有灵敏度高、特异性强、只有和革巴序 列杂交上了才会发出荧光等优点，被应用于荧光原位杂交。本专利技术通过对大量结核分枝杆 菌和化脓性链球菌菌株的16S rRNA序列进行比对，挑选化脓性链球菌的特异性序列，设计、 合成分子信标探针，建立稳定的分子信标原位杂交反应体系，克服了化脓性链球菌当前临 床检测的诸多问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分子信标探针，通过荧光原位杂交的手段，建立一种 快速、灵敏、特异性地检测样品中化脓性链球菌的方法。 -种快速检测化脓性链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的 碱基序列为： Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ； 所述探针的5'端用Cy3标记，3'端用BHQl标记，荧光基团激发波长552nm，检测 波长570nm。 进一步地，所述分子信标浓度为long/ μ L。 toon] 本专利技术还提供了一种快速检测化脓性链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包括： ⑴裂解液：4%氢氧化钠 (2)杂交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸钠，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0. 1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L分子信标探针，所述分子信标探针的碱基 序列为： Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ； (3)终止液：1 稀硫酸； (4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值为 10。 本专利技术最后提供了一种上述试剂盒快速检测化脓性链球菌的方法，其特征在于包 括如下步骤： ⑴吸取10 μ L样品滴在载玻片上，自然风干； (2)在风干的样品上加入IOyL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5 分钟； (3) 52 °C 杂交 10 分钟； (4)液侵泡1分钟，终止反应； (5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20 X物镜扫视和计数，用60或100X物 镜观察细菌形态。 本专利技术的技术要点或原理：突光原位杂交（Flourescence in situ Hybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或 组织内特异性DNA或RNA的方法；分子信标探针是一种具有独特发夹空间结构的探针，在 未与靶序列结合时，分子信标呈发夹结构，有一环序列（loop)和一茎序列（stem)，其中 环序列是与靶位点互补的碱基序列，而茎序列是与靶位点无关的互补序列；在探针的两端 分别标记有荧光基团和荧光猝灭基团，当探针处于发卡结构时，荧光基团和猝灭基团相邻， 产生能量共振转移效应，使得荧光基团被猝灭，不能产生荧光信号，而当探针与靶位点结合 时，发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光信号，通过荧光显微镜可以检测 到该突光信号。 本专利技术通过比对多个化脓性链球菌和其它链球菌的16S rRNA序列，筛选出1条化 脓性链球菌特有的靶序列。根据该靶序列，人工合成分子信标探针，其碱基组成为： Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ； 探针的5'端用Cy3标记，3'端用BHQl标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长 570nm〇 本专利技术通过大量实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为52°C，甲酰胺最佳浓度为 20%，分子信标最佳浓度为IOng/ μ L。 本专利技术分子信标探针5'端的荧光标记，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3'端 的荧光猝灭标记，包括但不限于DABCYL、BDH、BHQ1或TANRA等，荧光基团或荧光猝灭基团可 以根据现有技术进行添加。 本专利技术的分子信标探针能够用于检测的样本范围广泛，包括但不限于，痰、咽拭 子、胃灌洗液、支气管灌洗液、活体组织、吸引物、咳出物、体液（脊髓、胸腹水、心包液等）、 血液、脓液、骨髓、尿液、组织切片、食物样本、来自土壤、空气和水的样本，以及它们的培养 物。这些样本经相应处理后，原则上是只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏，均可使 用本专利技术的分子信标探针检测。这些样本的处理方法是本领域技术人员所掌握的，例如： 痰：痰液涂片法； 脓液：同痰液涂片法； 病灶组织：先用组织研磨器磨碎后再行涂片； 尿液：留全量夜尿，静置4?5h后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，离 心30min,取沉淀物涂片； 胸、腹水标本：参照尿液涂片法； 脑脊液：无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将 脑脊液离心沉淀，3000rpm,离心30min,弃上清液，取沉淀物涂片。 本专利技术的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测化脓性 链球菌。 【具体实施方式】 下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明 本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测化脓性链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：Beacon SPY：5’‑CY3‑CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1‑3’；所述探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm。
【技术特征摘要】
1. 一种快速检测化脓性链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱 基序列为： Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ； 所述探针的5'端用Cy3标记，3'端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长 570nm〇2. 如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标浓度为10ng/y L。3. -种快速检测化脓性链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (1)裂解液：4%氢氧化钠 ⑵杂交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/v)焦 磷酸钠，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7. 5)，1...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪冉，方华成，易春，刘振世，
申请(专利权)人：苏州达麦迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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