用于检测酿脓链球菌的LAMP试剂盒及其专用引物制造技术

本发明专利技术公开了一种酿脓链球菌的LAMP试剂盒及其专用引物。用于检测酿脓链球菌的LAMP引物，是根据酿脓链球菌转录调控基因spy1258的特异性保守靶序列设计的，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、以及环引物LF的组合。利用本发明专利技术可在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地定性检出纯菌、痰液、脑脊液及其它分泌物等样品中的酿脓链球菌，无需复杂仪器，为酿脓链球菌的检测提供了新的技术平台。

【技术实现步骤摘要】
用于检测酿脓链球菌的LAMP试剂盒及其专用引物
本专利技术属于生物
，涉及细菌的分子生物学，特别是涉及一种酿脓链球菌的LAMP试剂盒及其专用引物与其在检测酿脓链球菌中的应用。
技术介绍
酿脓链球菌临床感染及治疗现状酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，即A群链球菌(GroupAstreptococcus，GAS，是根据抗原构造不同定义为A群)，β溶血(是指能够完全使绵羊血细胞琼脂溶血)，是人体的重要致病菌之一，可以引起很多种疾病，引起的感染性疾病主要有急性咽炎、急性扁桃体炎，也可致肺部感染、猩红热、皮肤软组织感染，并可致全身性感染。酿脓链球菌也是引起变态反应性疾病风湿热和急性肾小球肾炎的间接原因。近年来，A群链球菌常引起严重的感染，由侵袭性A群链球菌(invasivegroupAstreptococcusinfections)引发的疾病的发病率增长，使人们对该类细菌感染更加关注。酿脓链球菌可侵袭任何年龄的人，但发病者多为儿童。正常人鼻咽部、皮肤可带菌，并有由肛门、阴道带菌引起暴发流行的报告。呼吸道与直接接触均可传播。亦有进食被污染食物引起咽峡炎暴发的报道。生活贫困、卫生条件差、居住拥挤、密切接触等均有助于酿脓链球菌感染的发生。目前，酿脓链球菌感染的治疗药物首选青霉素，但应考虑到可能有耐药菌株，应加大剂量或改用它药，如红霉素、克林霉素、第一代、二代头孢类抗生素等。最好参照当地药敏结果选用。检测酿脓链球菌的方法主要是传统的培养鉴定、血清学分析等，存在耗时和结果不易判定等缺点。因此，快速、准确检测病原菌，予以规范合理的抗生素治疗，是控制酿脓链球菌感染的有效措施。LAMP技术介绍环介导恒温核酸扩增技术(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是由Notomi(NotomiT，etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes2000；28(12):63.)专利技术的一种新型基因扩增技术。具体方法是针对靶基因(DNA或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列，结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断。LAMP技术具有快速高效、特异性强、灵敏度高、操作简单、检测直观和设备要求低等特点。自2000年专利技术以来，LAMP技术已被迅速用于病原微生物检测、遗传病诊断、食品安全等领域的分子生物学检测领域。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。MasakiImai等人(ImaiM，NinomiyaA，MinekawaH，etal.RapiddiagnosisofH5N1avianinfluenzavirusinfectionbynewlydevelopedinfluenzaH5hemagglutiningene-specificloop-mediatedisothermalamplificationmethod.JVirolMethods.2007；141(2):173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；NobuyukiHayashi等人(HayashiN，AraiR，TadaS，TaguchiH，OgawaY.DetectionandidentificationofBrettanomyces/Dekkerasp.yeastswithaloop-mediatedisothermalamplificationmethod.FoodMicrobiol.2007；24(7-8):778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前，国内外均未见有用于检测酿脓链球菌的LAMP试剂盒及其专用引物。
技术实现思路
本专利技术提供了用于对酿脓链球菌进行LAMP检测的引物，以实现酿脓链球菌的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。本专利技术所提供的用于检测酿脓链球菌的LAMP引物，是根据酿脓链球菌转录调控基因(theputativetranscriptionalregulatorgene)spy1258的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、脑脊液及其它分泌物等样品中的酿脓链球菌，所述LAMP引物由五条引物组成，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、以及环引物LF的组合；所述酿脓链球菌转录调控基因spy1258的特异性保守靶序列如序列表中SEQIDNO：1所示。具体来讲，所述用于对酿脓链球菌进行LAMP检测的五条引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2(F3)、SEQIDNO：3(B3)、SEQIDNO：4(FIP)、SEQIDNO：5(BIP)和SEQIDNO：6(LF)所示。所述的LAMP引物，为FIP和BIP、F3和B3、以及LF按摩尔比40:5:20的组合物。本专利技术的第二个目的是提供一种用于对酿脓链球菌进行LAMP检测的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒，包括上述用于对酿脓链球菌进行LAMP检测的引物。具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μl反应体系的试剂：20mMTris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNApolymerase，引物加入量为：40pmol引物FIP和BIP，5pmol引物F3和B3，20pmol引物LF。为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为酿脓链球菌标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。上述LAMP引物或试剂盒在酿脓链球菌LAMP检测中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第三个目的是提供一种酿脓链球菌的LAMP检测方法。本专利技术所提供检测方法，可包括以下步骤：1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，25μlLAMP反应体系包括：待测样品基因组DNA2μl，20mMTris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNApolymerase，引物加入量为：40pmol引物FIP和BIP，5pmol引物F3和B3，20pmol引物LF；LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温45-55min；2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在酿脓链球菌，橙色表示待测样品中不存在酿脓链球菌；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在酿脓链球菌，浊度无变化表示待测样品中不存在酿脓链球菌。本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测酿脓链球菌的LAMP引物，是根据酿脓链球菌转录调控基因spy1258的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、脑脊液及其它分泌物等样品中的酿脓链球菌，所述LAMP引物由五条引物组成，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、以及环引物LF的组合；所述酿脓链球菌转录调控基因spy1258的特异性保守靶序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.用于检测酿脓链球菌的LAMP引物，是根据酿脓链球菌转录调控基因spy1258的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、脑脊液及其它分泌物样品中的酿脓链球菌，所述LAMP引物由五条引物组成，包括序列表中SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的外引物F3和B3、序列表中SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示的内引物FIP和BIP、以及序列表中SEQIDNO：6所示的环引物LF的组合；所述酿脓链球菌转录调控基因spy1258的特异性保守靶序列如序列表中SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的LAMP引物，其特征在于：所述的LAMP引物，为F3和B3、FIP和BIP、以及LF按摩尔比5:40:20的组合物。3.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁静，赵向娜，贺晓明，李环，黄思妺，刘威，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11