一种拯救流感病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种拯救重组流感病毒的方法。该方法包括：1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2、PB1、PA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2、NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体。2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。从该拯救重组流感病毒的方法中得到的重组流感病毒疫苗株在鸡胚中具有高复制力，比传统疫苗在鸡胚中的生长滴度也要高，通过对疫苗种子毒进行抗原性检测发现，疫苗种子毒的抗原性与亲本病毒没有明显差异。

【技术实现步骤摘要】
一种拯救流感病毒的方法
本专利技术涉及病毒疫苗生产领域中一种拯救流感病毒的方法，特别涉及在鸡胚中具有高繁殖力的流感病毒疫苗株的制备方法。
技术介绍
H9N2亚型禽流感病毒是一种低致病性禽流感病毒，主要感染鸡、鸭、鹅、候鸟等禽类，但可造成蛋鸡的产蛋量严重下降，肉鸡和青年鸡的复合型呼吸道疾病和死淘率升高，造成严重的经济损失，目前H9N2亚型禽流感病毒已经成为流行于我国鸡群中的主要流感病毒亚型。值得注意的是，H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽类，而且无需经过中间宿主即可突破种间屏障感染哺乳动物和人，自1998年全球首次发现人感染H9N2亚型禽流感病毒病例后，人感染H9N2亚型禽流感病毒病例时有发生，凸显出其公共卫生学意义。因此，对禽流感病毒进行连续的分子病毒学监测，分析禽流感病毒变异规律，筛选出合适的疫苗株，研制出高效、安全、工艺简单、价格低廉的禽流感病毒疫苗是急需的。全病毒灭活苗是人们主要使用的禽流感疫苗，多用鸡胚制备而成。因此，一个理想的疫苗株首先应该在鸡胚中生长良好而且安全，然而，绝大多数流感病毒自然株对鸡胚有致病性，而且病毒的生长滴度也较低，这为大批量生产禽流感疫苗带来了诸多不便。为了克服这一缺点，目前多用遗传重组方法制备高繁殖力的预备疫苗株。H9N2亚型禽流感病毒为A型流感病毒，A型流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，共有8个独立的RNA片段组成，编码10种蛋白质。片段1-3编码RNA依赖的RNA聚合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2，片段2编码聚合酶亚基PB1，片段3编码聚合酶亚基PA；片段4编码血凝素HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种基质蛋白M1和M2，是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NS1和NS2。血凝素HA和神经氨酸酶NA经常发生抗原漂移和转换，是导致流感暴发的主要原因。人H1N1流感病毒A/PR/8/34(简称PR8)是一株鸡胚适应病毒株，能在鸡胚中有效地复制。因此，疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组(6+2模式)构建8质粒拯救系统，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何制备出在鸡胚中繁殖力高于传统6+2模式得到的重组病毒毒株。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了8+7模式拯救流感病毒的方法，该方法将流感病毒鸡胚适应株的7个基因片段(HA除外)与待拯救流感病毒毒株的8个基因片段共转染包装细胞，使除待拯救流感病毒毒株的编码HA的RNA片段外的14个RNA片段自由组合，进行病毒拯救，得到重组流感病毒。本专利技术所提供的拯救流感病毒的方法(也就是构建重组流感病毒的方法)，包括以下步骤：1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子和编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子，以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子和编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体，所述15个重组表达载体为下述a1-a15中的重组表达载体：a1、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB2基因表达载体；a2、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB1基因表达载体；a3、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PA基因表达载体；a4、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NP基因表达载体；a5、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NA基因表达载体；a6、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株M基因表达载体；a7、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NS基因表达载体；a8、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体；a9、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB1基因表达载体；a10、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PA基因表达载体；a11、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株HA基因表达载体；a12、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NP基因表达载体；a13、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NA基因表达载体；a14、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株M基因表达载体；a15、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NS基因表达载体；2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒可为A型流感病毒。上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒鸡胚适应株可为A/PR/8/34，所述待拯救流感病毒毒株可为A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)。上述拯救流感病毒的方法中，所述流感病毒鸡胚适应株中PB2是SEQIDNo.9的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQIDNo.9由2280个核苷酸组成，其编码序列是第1-2280位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中PB1是SEQIDNo.15的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQIDNo.15由2274个核苷酸组成，其编码序列是第1-2274位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中PA是SEQIDNo.14的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQIDNo.14由2151个核苷酸组成，其编码序列是第1-2151位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中NP是SEQIDNo.12的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质，SEQIDNo.12由1497个核苷酸组成，其编码序列是第1-1497位核苷酸；所述流感病毒鸡胚适应株中NA是SEQIDNo.本文档来自技高网...

【技术保护点】
拯救流感病毒的方法，包括以下步骤：1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子和编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子，以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子和编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体，所述15个重组表达载体为下述a1‑a15中的重组表达载体：a1、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB2基因表达载体；a2、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB1基因表达载体；a3、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PA基因表达载体；a4、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NP基因表达载体；a5、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NA基因表达载体；a6、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株M基因表达载体；a7、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NS基因表达载体；a8、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体；a9、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB1基因表达载体；a10、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PA基因表达载体；a11、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株HA基因表达载体；a12、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NP基因表达载体；a13、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NA基因表达载体；a14、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株M基因表达载体；a15、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NS基因表达载体；2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒。...

【技术特征摘要】
1.拯救流感病毒的方法，包括以下步骤：1)将编码流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子、编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子和编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子，以及编码待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子、编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子和编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子这15个cDNA分子每个单独插入真核细胞表达载体，得到15个重组表达载体，所述15个重组表达载体为下述a1-a15中的重组表达载体：a1、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB2基因表达载体；a2、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PB1基因表达载体；a3、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株PA基因表达载体；a4、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NP基因表达载体；a5、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NA基因表达载体；a6、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株M基因表达载体；a7、含有编码所述流感病毒鸡胚适应株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为鸡胚适应株NS基因表达载体；a8、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB2基因表达载体；a9、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PB1的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PB1基因表达载体；a10、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中PA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株PA基因表达载体；a11、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中HA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株HA基因表达载体；a12、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NP的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NP基因表达载体；a13、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NA的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NA基因表达载体；a14、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中M1和M2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株M基因表达载体；a15、含有编码所述待拯救流感病毒毒株中NS1和NS2的cDNA分子的重组表达载体，其名称为待拯救流感病毒毒株NS基因表达载体；2)将所述15个重组表达载体导入包装细胞中，得到重组流感病毒；所述流感病毒鸡胚适应株为人H1N1流感病毒A/PR/8/34，所述待拯救流感病毒毒株为A/chicken/Hebei/YT/2010(H9N2)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流感病毒鸡胚适应株中PB2是SEQIDNo.9的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中PB1是SEQIDNo.15的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中PA是SEQIDNo.14的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中NP是SEQIDNo.12的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中NA是SEQIDNo.11的第1-1365位核苷酸序列编码的蛋白质；所述流感病毒鸡胚适应株中M1是SEQIDNo.10的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中M2的氨基酸序列如SEQIDNo.18所示；所述流感病毒鸡胚适应株中NS1是SEQIDNo.13的第1-693位核苷酸序列编码的蛋白质，所述流感病毒鸡胚适应株中NS2的氨基酸序列如SEQIDNo.19所示；所述待拯救流感病毒毒株中PB2是SEQIDNo.3的第1-2280位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中PB1是SEQIDNo.4的第1-2274位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中PA是SEQIDNo.5的第1-2151位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中HA是SEQIDNo.1的第1-1683位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中NP是SEQIDNo.6的第1-1497位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中NA是SEQIDNo.2的第1-1401位核苷酸序列编码的蛋白质；所述待拯救流感病毒毒株中M1是SEQIDNo.7的第1-759位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中M2的氨基酸序列如SEQIDNo.16所示；所述待拯救流感病毒毒株中NS1是SEQIDNo.8的第1-654位核苷酸序列编码的蛋白质，所述待拯救流感病毒毒株中NS2的氨基酸序列如SEQIDNo.17所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB2的cDNA分子是CPB21或CPB22的cDNA分子：CPB21、其编码序列是序列表中SEQIDNo.9的第1-2280位核苷酸的cDNA分子；CPB22、其核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.9的cDNA分子；编码所述流感病毒鸡胚适应株中PB1的cDNA分子是CPB11或CPB12的cDNA分子：CPB11、其编码序列是序列表中SEQIDNo.15的第1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙怡朋，刘金华，沈晔，蒲娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11