一种DNA组装和克隆的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种简便的DNA组装和克隆方法。本发明专利技术所述DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模板进行聚合酶链式反应，获得双链环状DNA；其中插入片段两端分别带有与线性载体两端重叠的重叠序列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。本发明专利技术所述DNA组装和克隆的方法反应体系简单、成本低，操作简便、易于平行操作，对复杂基因片段库、组合基因片段库、多基因通路的DNA组装和克隆具有明显的优势，可广泛应用于单一基因、多基因以及基因片段库的DNA组装和克隆，特别适用于高通量基因合成与组装。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及基因合成的方法，尤其是涉及一种简便的DNA组装和克隆方法。
技术介绍
DNA组装和克隆是分子生物学研究中最基本、最常用的技术手段。基因组学、合成生物学的快速发展对DNA组装和克隆技术提出了越来越高的要求。根据插入片段和载体上是否需要具有特异性位点或序列，可以将目前的DNA组装和克隆方法分为两大类，即序列依赖型和非序列依赖型。序列依赖型克隆是基于限制性酶切-连接或位点特异性重组的方法。限制性酶切-连接是常用的经典克隆方法，即插入片段和载体都通过相应的限制性内切酶切割，产生两个单链粘性末端或平齐末端，然后在DNA连接酶的作用下重新形成磷酸二酯键而得到环化的重组质粒。限制性内切酶和连接酶的商品化和普及使构建单一基因与目标载体的重组质粒变得简单，但是操作步骤较繁琐、耗时。受基因序列中原有酶切位点的限制，当插入多条基因时，不易找到可利用的酶切位点，同时还可能受到因载体自连而造成的假阳性克隆的干扰。而基于位点特异性重组的克隆方法则无需限制性内切酶、DNA连接酶以及许多针对于亚克隆的体外操作，较之更为快速和简便，如通用载体质粒融合系统(univector plasmid-fusion system，UPS)和通路克隆系统(gateway cloning system)等。UPS是建立在噬菌体PI的Cre-loxp位点特异性重组之上的质粒融合系统，催化含有目的基因的特殊载体(pUNI)与含有相关调控信息的宿主载体(pHOST)之间质粒融合，融合质粒经过选择后，使目的基因受控于宿主载体上的新启动子等调控元件而完成目的基因-表达载体的构建。gateway系统是基于λ噬菌体位点特异重组系统，可将DNA插入片段从一个表达载体快速简便地转移到另一个表达载体，同时保证方向和阅读框的正确。受到DNA特异性位点的限制，这两种克隆方法对于较复杂或是多片段组装的DNA合成与克隆依然表现出很大的局限性。非序列依赖型克隆方法主要是基于同源重组的原理，如LIC、MAGIC、SLIC、Gibson、In-Fusion、PIPE等等，但这些克隆方法严格意义上的完全不依赖于DNA序列，还是需要在插入片段和目标载体的交叠区域缺失或多出一些碱基，形成相互匹配的粘性末端，这样不仅增加了克隆的步骤，而且还要应用昂贵的组合酶体系，所以在时间和经济成本上并未表现出明显的优势。同时，这些方法的退火步骤通常都是在室温下进行的，使非特异性杂交的几率增加，进而造成DNA的错误组装。每种克隆方法各有优缺点和最适用的领域，但对于复杂基因片段库、基因线路图、代谢途径等的合成，则需要更为精确、高效、简便、经济的DNA组装和克隆方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种简便的DNA组装和克隆的方法，该方法中载体与插入片段互为引物和模板，通过聚合酶进行延伸反应连接，形成双链环状DNA，直接用于转化，较现有方法更为高效、简便、经济。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案一种DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模板进行聚合酶链式反应，获得双链环状DNA；其中插入片段两端分别带有与线性载体两端重叠的重叠序列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。在一些实施方案中，所述线性载体与插入片段在反应体系中的摩尔比为(0.1:1)～(10:1)。在一些实施方案中，所述线性载体的终浓度为0.1ng/μl～20ng/μl。在一些实施方案中，所述重叠序列的长度为10bp～40bp。在一些实施方案中，所述重叠序列的Tm值差异范围在3℃以内。进一步的，在一些优选实施方案中，所述重叠序列的Tm值范围为50℃～70℃。在一些实施方案中，所述反应的循环数为1个～40个。进一步的，在一些优选实施方案中，其中所述反应的循环数为1个～10个。进一步的，在一些优选实施方案中，其中所述反应的循环数为5个～40个。更进一步的，在一些优选实施方案中，所述反应的退火为以0.1-0.5℃/s的速率缓慢降温退火。本专利技术所述DNA组装和克隆的方法，至少具有以下有益效果中的一种：第一，需要较少的循环，最少只需1个循环即可获得全长DNA，并且可一次性组装长达20kb的DNA片段；第二，无需外加引物引发反应，反应过程中对插入片段和载体片段不进行数量扩增，只有链延长；第三，反应得到的产物为环状重组质粒，可以直接转化至受体细胞，完成克隆，无需再经过酶切连接等后续处理步骤。第四，反应过程仅基于DNA聚合酶延伸反应原理，不涉及复杂的重组过程，反应时间短、突变几率低，反应效率和保真度高；第五，反应体系简单、成本低，操作简便、易于平行操作，对复杂基因片段库、组合基因片段库、多基因通路的DNA组装和克隆具有明显的优势，可广泛应用于单一基因、多基因以及基因片段库的DNA组装和克隆，特别适用于高通量基因合成与组装。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示基因组装和克隆方法流程示意图，其中，图A为单一基因，图B为多基因片段，图C为多基因片段库，图D基因组装和克隆方法反应原理示意图；图2示单一基因组装产物鉴定结果，图A为DNA组装反应产物电泳图，其中，M为NEB 1kb DNA标准品，泳道1和2分别为PCR循环数为1或5的产物；图B为对所得阳性克隆进行菌落PCR鉴定的结果，其中，M为NEB1kb DNA标准品，泳道1～8和9～16分别为PCR反应循环数为1和5的产物；图3示多基因片段组装产物鉴定结果，图A为DNA组装反应产物电泳图，其中，M为NEB 1kb DNA标准品，泳道1-3分别为PCR循环数为2、5或10的产物；图B为DNA组装反应产物电泳图，M为NEB 1kb DNA标准品，泳道1为PCR循环数为20的产物；图4示多基因片段库组装产物鉴定结果，图A为方法a的组装反应产物电泳图，其中，M为NEB 1kb DNA标准品，泳道1-3分别为PCR循环数为2、10和20的产物；图B为方法b的组装反应产物电泳图，其中，M为NEB 1kbDNA标准品，泳道1为PCR循环数为25的产物。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模板进行聚合酶链式反应，获得双链环状DNA；其中插入片段两端分别带有与线性载体两端重叠的重叠序列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠的重叠序列。

【技术特征摘要】
1.一种DNA组装和克隆的方法，为插入片段和线性载体互为引物和模
板进行聚合酶链式反应，获得双链环状DNA；其中插入片段两端分别带有与
线性载体两端重叠的重叠序列，线性载体两端分别带有与插入片段两端重叠
的重叠序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述线性载体与插入片段在反应体
系中的摩尔比为(0.1:1)～(10:1)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述线性载体的终浓度为0.1ng/μl～
20ng/μl。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重叠序列的长度为10bp～40bp。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王璐，田敬东，冯淼，王丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12