新型合成-调控sRNA及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种降低原核生物中基因表达的新型的定制合成sRNA，其制备方法及其应用，尤其涉及一种合成sRNA，其包括源自MicC、SgrS和MicF中任何一种的sRNA的Hfq结合位点和与靶基因mRNA成碱基对的区域，还涉及该合成sRNA的制备方法及其应用。本发明专利技术的合成sRNA的优点在于，可通过调控合成sRNA与靶基因mRNA的结合能力来控制靶基因的抑制程度。利用调控靶基因表达的合成sRNA，能够无需传统的基因缺失方法而有效构建重组微生物并能够降低靶基因的表达，因而合成sRNA对重组微生物的生产很有用。此外，合成sRNA可快速应用至各种菌株，因而非常适合测定菌株的代谢能力以及选择最适菌株。此外，通过利用合成sRNA操控代谢通量得到的并高效生产酪氨酸或尸胺的重组微生物在医药和工业领域非常有用。换句话说，利用本发明专利技术的sRNA可使选择表达将被抑制以用于高效生产代谢产物的靶基因变得容易。因此，合成sRNA可用于构建有效生产各种代谢产物的重组菌株以及用于建立生产各种代谢产物的有效方法，因而非常有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型合成-调控sRNA及其制备方法
本专利技术涉及一种降低原核生物中基因表达的新型的定制sRNA，其制备方法及其应用，尤其涉及一种合成的sRNA及其制备方法与应用，所述合成的sRNA包括源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点以及与靶基因mRNA碱基配对的区域。
技术介绍
近年来，全球对于环境问题和有限资源损耗的关注日益增加。作为解决此类问题的可选方法，基于环境友好型和可再生的有机体生产体系的构建日益引起人们的兴趣。可通过调控有机体的代谢途径，优化所需代谢产物的代谢通量来构建这些体系，并且在该调控代谢途径的过程中需要多种分子生物学技术。调控代谢途径的方法包括增加生物合成过程所需的酶的表达以提高代谢通量的方法，以及阻止用于细胞生长和生产其它代谢产物的代谢通量以及缺失基因以生产所需代谢产物的方法。目前广泛应用的基因缺失方法是这样一种方法，其中利用重组酶将待删除的基因置换为任何与其同源的序列，从而导致基因功能丧失(Datsenkoetal,PNAS,97(12):6640-6645,2000)。然而，这种基因缺失方法存在以下问题。首先，基因缺失所需时间相对较长。考虑到用同源序列置换染色体基因所需的时间以及从染色体中移除抗生素抗性基因(用于筛选其中正常移除了基因缺失的细胞)所需的时间，通常需要一周或更长的时间来移除一个基因。与近年来快速发展的分子生物学技术相比，这种长的基因缺失时间与关注于通过调控代谢途径来高效生产代谢产物的代谢工程的发展相冲突。其次，基因缺失导致基因功能的完全丧失。这表明基因的表达水平不能被调控至所需水平。为了在细胞内代谢途径中有效生产所需代谢产物，尝试基因缺失来阻断进入代谢途径的代谢通量。然而，如果受阻的代谢通量产生细胞生长所必需的物质，则基因缺失的细胞的生长将会被显著抑制或不会发生。为了使所需代谢物的生产效率最大化，生产所需代谢产物的细胞应该很容易生长，同时所需代谢物的代谢通量也应被最优化。因此，需要一种能够通过调控基因表达水平来生产所需物质同时维持细胞生长的方法，而不是简单地为了调节代谢通量而删除基因。第三，通过传统的基因缺失方法从染色体删除的基因难以修复。此外，如果尝试删除其它菌株中的相同基因，则所有的过程都需要重新尝试，因此需要大量的时间和精力。因此，为了克服传统基因缺失方法的局限性，应该可以无需改变菌株的染色体序列而降低目的基因的表达水平。此外，应该可以调控基因的表达水平并很容易地将对相同基因的表达调控应用于其它菌株。进一步，需要以快速便捷的方式构建并应用基因调控体系。因此，本专利技术人尝试利用满足上述要求的方法来构建短的定制合成的sRNA。目前已知总共有101种大肠杆菌sRNA(Pichonetal.,NucleicAcidsResearch,DOI:10.1093/nar/gkr1141,2011)，其机制目前正在研究中。目前已报道，大量sRNA即使具有不同的序列也会形成特定的二级结构，Hfq蛋白识别并结合到这些sRNA。Hfq的功能是增加sRNA的半衰期，这样即使仅有少量sRNA也能有效地起作用，并且Hfq协助sRNA结合到靶mRNA，以使靶mRNA能迅速起作用，并使RNase结合到靶mRNA，以促进靶mRNA的降解，从而更有效地降低基因的表达。一直在不断研究大肠杆菌sRNA的基本功能，但是关于利用上述机制来构建合成sRNA的报道很少或没有。根据最近有关构建大肠杆菌sRNA的报道，已经通过随机诱变和筛选构建了有效的sRNA(Sharmaetal,ACSSyntheticBiology,DOI:10.1021/sb200001q,2011)。因此，为了克服传统基因缺失方法的局限性，本专利技术人已经做了大量努力来构建一种新型的、短的定制合成sRNA，结果构建了一种合成sRNA，其包括源自MicC、SgrS和/或MicF的Hfq结合位点以及与诸如DsRed2mRNA、AraCmRNA、KanRmRNA或LuxRmRNA的靶mRNA同源的区域，并发现对靶mRNA表达的测试结果显示，可不依赖传统的随机方法而构建有效的sRNA。此外，本专利技术人构建了一种抑制tyrR(酪氨酸调控因子)、csrA(碳储存调控因子)、pgi(葡萄糖-6-磷酸异构酶)、ppc(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)等的表达的合成sRNA，并发现这些合成sRNA显示的效果类似于实际的基因缺失的效果，这些合成sRNA可用于调控所需代谢产物的生产，从而完成了本专利技术。
技术介绍
部分中描述的信息仅仅是为了加强对本专利技术背景的理解，可能并不含有形成了本专利技术所属
的普通技术人员已知的现有技术的信息。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种新型的、短的定制合成sRNA，其制备方法及其应用，所述合成sRNA克服了传统的基因缺失方法的局限性，并且可用于高效调控各种靶基因的mRNA表达。为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于抑制原核生物中基因表达的sRNA(小分子调控RNA)，所述sRNA包括：源自MicC、SgrS和MicF中的任何一个的sRNA的Hfq结合位点以及与靶基因mRNA成碱基配对的区域。本专利技术还提供一种编码sRNA的分离的核酸。本专利技术还提供一种包括编码sRNA的分离的核酸的表达载体。本专利技术还提供一种导入了sRNA的重组微生物。本专利技术还提供一种用所述表达载体转化的重组微生物。本专利技术还提供一种制备sRNA的方法，所述方法包括将编码与靶基因mRNA成碱基配对的区域的核酸连接到编码源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点的核酸。本专利技术还提供一种抑制靶基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：在原核生物中导入或表达sRNA；以及抑制靶基因的mRNA的表达。本专利技术还提供一种用于抑制原核生物中基因表达的组合物，所述组合物包括sRNA。本专利技术还提供一种用于筛选需要被缺失的基因以生产有用物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)对存在于用于生产有用物质的菌株并参与有用物质的生物合成途径的基因中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；以及(b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑制的基因作为需要删除的基因，以生产有用物质。本专利技术还提供一种改良用于生产有用物质的菌株的方法，所述方法包括以下步骤：(a)对存在于用于生产有用物质的菌株并参与有用物质的生物合成途径的基因中的至少一种基因，利用靶向所述基因的sRNA，抑制基因表达；(b)如果有用物质的产量通过抑制基因的表达而增加，则选择表达被抑制的基因作为需要删除的基因，以生产有用物质；以及(c)构建缺失了选定基因或选定基因的组合的重组菌株。本专利技术还提供一种具有增强的生产酪氨酸能力的重组微生物，所述重组微生物是通过使具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的功能失活而获得的。本专利技术还提供一种能够生产苯酚/酚类的重组微生物，所述重组微生物是通过在上述重组微生物中导入或扩增tpl基因而获得的。本专利技术还提供一种生产具有增强的生产酪氨酸的能力的重组微生物的方法，所述方法包括使具有酪氨酸生物合成途径的宿主细胞中的tyrR和csrA基因的功能失活。本专利技术还提供一种具有增强的生产尸胺能力的重组微生物，所述重组微生物是通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抑制原核生物中基因表达的sRNA，所述sRNA包括：源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点；以及与靶基因mRNA成碱基配对的区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.11 KR 10-2012-00036091.一种用于抑制原核生物中基因表达的合成sRNA，所述sRNA包括：(i)源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的sRNA的Hfq结合位点；以及(ii)与靶基因mRNA成碱基配对的区域，其中与靶基因mRNA成碱基配对的区域被构建成与所述靶基因mRNA的结合能在-20kcal/mol至-40kcal/mol的范围内；其中与靶基因mRNA成碱基配对的区域与所述靶基因mRNA的核糖体结合位点成碱基配对，且所述区域具有19-37个核苷酸的长度；以及其中所述源自MicC的sRNA的Hfq结合位点是由SEQIDNo:140的位置1-30组成的区，所述源自SgrS的sRNA的Hfq结合位点是由SEQIDNo:139的位置154-190组成的区，且源自MicF的sRNA的Hfq结合位点是由SEQIDNo:141的位置1-33组成的区。2.如权利要求1所述的sRNA，其中不与靶基因mRNA结合的位点是通过在与所述靶基因mRNA成碱基配对的区域中缺失或置换一个或多个核苷酸而形成的。3.如权利要求1所述的sRNA，其中不与靶基因mRNA结合的位点是通过在与所述靶基因mRNA成碱基配对的区域中插入或缺失一个或多个核苷酸而形成的。4.如权利要求1所述的sRNA，其中所述sRNA包括源自MicC的sRNA的Hfq结合位点。5.如权利要求1所述的sRNA，其中所述原核生物选自由大肠杆菌、根瘤菌、双歧杆菌、红球菌、念珠菌属、欧文氏菌、肠杆菌、巴氏杆菌、曼氏杆菌、放线杆菌、伴放线菌、黄杆菌、弧菌、假单胞菌、固氮菌、不动杆菌、劳尔氏菌、农杆菌、根瘤菌、红杆菌、单胞发酵菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、乳球菌、链球菌、乳杆菌、梭菌、棒状杆菌、链霉菌、双歧杆菌和圆杆菌构成的组。6.如权利要求1所述的sRNA，其中靶基因mRNA是选自以下基因的mRNA：DsRed2、LuxR、AraC、编码卡那霉素抗性的基因KanR、编码酪氨酸调控因子的tyrR、编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的ppc、编码碳储存调控因子的csrA、编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi、编码柠檬酸合成酶的glt、编码乙酰辅酶A羧基转移酶的α-亚基的accA、编码生物素化的生物素-羧基载体蛋白的accB、编码乙酰辅酶A羧化酶的accC、编码乙酰辅酶A羧基转移酶的β-亚基的accD、编码丙酮酸脱氢酶复合体的E1p成分的亚基的aceE、编码丙酮酸脱氢酶的aceF、编码丙酸激酶/乙酸激酶活性的ackA、编码调控精氨酸脱羧酶体系的正DNA结合转录调控因子的adiY、编码乙酰谷氨酸激酶的argB、编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶的argC、编码精氨基琥珀酸合酶的argG、编码精氨基琥珀酸裂解酶的argH、编码激活asnA表达的转录调控因子的asnC、编码天冬氨酸裂氨酶的aspA、编码CRP转录双向调控因子的crp、编码作为由碳饥饿诱导的基因产物的预测蛋白CsiD的csiD、编码DNA结合转录抑制因子的csiR、编码用于转运以及利用核糖核苷和脱氧核糖核苷所需的转录因子的cytR、编码作为已知在厌氧条件下负责摄入C4－二羧化物如延胡索酸盐的三个转运体之一的DcuA转运体的dcuA、编码戊磷酸变位酶的deoB、编码脱氧核苷－磷酸醛缩酶的deoC、编码参与与脱氧核糖核苷酸转运和分解相关的基因的阴性表达的转录抑制因子DeoR即“脱氧核糖调控因子”的deoR、编码β-酮乙酰-ACP合酶KASIII的fabH、编码脂酰辅酶A的fadD、编码作为对脂肪酸降解调节子和乙酸盐代谢施加负调控的多功能双向调控因子的FadR脂肪酸降解调节子的fadR、编码果糖-1,6-二磷酸酶的fbp、编码作为介导从有氧生长到无氧生长的过渡的主要转录调控因子的FNR的fnr、编码作为通过不同能量代谢途径调节碳流方向但独立于CRP调控因子的具有多效性作用的双向转录调控因子的FruR的fruR、编码细胞分裂的必要蛋白FtsL的ftsL、编码细胞分裂的必要蛋白FtsQ的ftsQ、编码细胞分裂的必要蛋白FtsW的ftsW、编码细胞分裂的必要蛋白FtsZ的ftsZ、编码Fur-Fe+2DNA结合转录双向调控因子的fur、编码NADP+-依赖型琥珀酸半缩醛脱氢酶的gabD、编码APC转运体的gabP、编码4-氨基丁酸转氨酶的gabT、编码谷氨酸脱羧酶A亚基的gadA、编码谷氨酸脱氢酶B亚基的gadB、编码GABAAPC转运体的gadC、编码GntR家族转录调控因子或glc操纵转录激活因子的glcC、编码甘油激酶的glpK、编码sn-甘油-3-磷酸抑制剂的glpR、编码果糖1,6-二磷酸酶II的glpX、编码柠檬酸合成酶的gltA、编码溶源化调控因子的hfld、编码作为球形调节蛋白的整合宿主因子IHF的ihfa、编码作为球形调节蛋白的整合宿主因子IHF的ihfb、编码乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶的ilvB、编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC、编码二羟酸脱水酶的ilvD、编码乙酰乳酸合酶II的N端片段的ilvG_1、编码乙酰乳酸合酶II的C端片段的ilvG_2、编码乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶ilvH、编码ilvGEDA操纵子前导肽的ilvL、编码乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶的ilvM、编码乙酰羟丁酸酯合酶/乙酰乳酸合酶的ilvN、编码预测的小分子蛋白的ilvX、编码抑制参与对DNA损伤的细胞应答的几种基因的转录的LexA的lexA、编码UDP-3-O-乙酰基-N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶的lpxC、编码参与调控与抗生素抗性、氧化应激、有机溶剂和重金属相关的基因的MarA的marA、编码MetJ转录抑制子的metJ、编码作为控制与钼转运、钼酶合成以及与钼相关功能的操纵子的转录的主要调控因子的ModE的modE、编码L-天冬氨酸氧化酶的nadB、编码硝酸盐/亚硝酸盐响应调控因子的narL、编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck、编码作为调控与丙酮酸脱氢酶复合体有关的基因的“丙酮酸脱氢酶复合体调控因子”的PdhR的PdhR、编码作为与适应低Mg2+环境和控制抗酸性基因相关的双组分调节体系phoQ/phoP中的一员的PhoP-磷酸化DNA结合转录双向调控因子的phoP、编码PnuCNMN转运体的pnuC、编码磷酸烯醇丙酮酸合成酶的ppsA、编码磷酸乙酰转移酶的pta、编码腺苷酸琥珀酸合成酶的purA、编码腺苷酸琥珀酸裂解酶的purB、编码作为调控与嘌呤核苷酸生物合成及其自身合成相关的几种基因的PurR二聚体的PurR-次黄嘌呤DNA结合转录抑制因子的purR、编码4-氨基丁酸转氨酶的puuE、编码核糖ABC转运体的rbsA、编码核糖ABC转运体的rbsB、编码核糖吡喃酶的rbsD、编码核糖激酶的rbsK、编码作为负性自动调节并控制与核糖代谢和转运相关的操纵子的转录的“核糖抑制因子”的转录因子RbsR的rbsR、编码RcsB-BglJDNA结合转录激活因子的rcsB，其中“调控荚膜合成B”的RcsB蛋白为属于多组分RcsF/RcsC/RcsD/RcsA-RcsB磷酸中继体系且与调控荚膜多糖可拉酸的合成、细胞分裂、周质蛋白、游动性和小分子RNA有关的响应调控因子、编码直接或间接调控与复杂的嘧啶代谢途径相关的基因RutR的rutR、编码α-酮戊二酸还原酶/D-3-磷酸甘油脱氢酶的serA、编码磷酸羟苏氨酸转氨酶/3-磷酸丝氨酸转氨酶的serC、编码参与超氧化物和一氧化氮移除的双向转录激活因子的soxS、编码SroD小分子RNA的sroD、编码葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶的zwf、编码天冬酰胺合成酶A的asnA、编码天冬酰胺合成酶B的asnB、编码氨甲酰磷酸合成酶的carA、编码氨甲酰磷酸合成酶的carB、编码D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶B的ddlB、编码胸苷磷酸化酶/尿嘧啶磷酸化酶的deoA、编码嘌呤核苷磷酸化酶deoD基因型的deoD、编码参与柠檬酸厌氧分解代谢的双向转录调控因子的dpiA、编码主要作用为组织和保持类核结构的小分子DNA-结合和弯曲蛋白的“倒位刺激因子”Fis的fis、编码GadE调控与谷氨酸依赖体系相关的基因的转录的gadE、编码调控与谷氨酸依赖体系相关的基因的转录的GadW的gadW、编码调控与谷氨酸依赖体系相关的基因的转录的GadX的gadX、编码GlpF甘油MIP通道的glpF、编码IlvYDNA-结合转录双向调控因子的ilvY、编码ilvB操纵子前导肽的ivbL、编码L-2-羟基戊二酸氧化酶的lhgO、编码硫辛酰胺脱氢酶的lpd、编码作为大肠杆菌中至少10％的基因的双向转录调控因子的Lrp的lrp、编码O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶的metB、编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的metL、编码磷酸-N-乙酰胞壁酰-五肽转移酶的mraY、编码功能未知的蛋白的mraZ、编码UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸2,6-二氨基庚二酸连接酶的murE、编码D-丙氨酸-D-丙氨酸-加成酶的murF、编码N-乙酰葡糖氨基转移酶的murG、编码与氮限制条件下的氮代谢相关的Nac调控物的nac、编码喹啉酸合成酶的nadA、编码作为调控与对抗一氧化氮的细胞相关的基因的“亚硝酸盐敏感抑制剂”的NsrR的nsrR、编码泛酸合成酶的panC、编码天冬氨酸1-脱羧酶的panD、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的pgl、编码天冬氨酸氨甲酰转移酶，pyrB亚基的pyrB、编码二氢乳清酸酶的pyrC、编码天冬氨酸氨甲酰转移酶，PyrI亚基的pyrL、编码转录双向调控因子Rob的rob、编码核酮糖磷酸3-差向异构酶的rpe、编码转醛醇酶A的talA、编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的thrA、编码高丝氨酸激酶的thrB、编码苏氨酸合酶的thrC、编码thr操纵子前导肽的thrL、编码转酮醇酶I的tktA、编码转酮醇酶II的tktB、编码作为torCAD操纵子响应调控因子的TorR的torR。7.一种分离的核酸，编码如权利要求1至6中任一项所述的sRNA。8.一种表达载体，包括编码如权利要求1至6中任一项所述的sRNA的分离的核酸。9.一种重组微生物，导入有如权利要求1至6中任一项所述的sRNA。10.一种重组微生物，转化有如权利要求8所述的表达载体。11.一种制备sRNA的方法，所述方法包括将编码与靶基因mRNA成碱基配对的区域的核酸连接到编码源自MicC、SgrS和MicF中的任何一种的所述sRNA的Hfq结合位点的核酸，其中与靶基因mRNA成碱基配对的区域被构建成与所述靶基因mRNA的结合能在-20kcal/mol至-40kcal/mol的范围内；其中与靶基因mRNA成碱基配对的区域与所述靶基因mRNA的核糖体结合位点成碱基配对，且所述区域具有19-37个核苷酸的长度；以及其中所述源自MicC的sRNA的Hfq结合位点是由SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：李相烨，罗度钧，柳承珉，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR