miRNA在胎盘组织中的表达制造技术

本发明专利技术提供了用于免疫调节的与在妊娠期间产生免疫耐受性相关的人类miRNA以及其片段、衍生物和变体。所述miRNA可以用于诊断和治疗与免疫反应失调相关的病症、自身免疫病症、妊娠相关疾病、胎盘形成障碍或问题和由同种异体移植引起的并发症。另外，描述了用于诊断和治疗所述病症的新的药物组合物和诊断组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】m i RNA在胎盘组织中的表达
本专利技术总体上涉及可用于免疫调节的结合分子，特别是与调节免疫系统相关或可用于调节免疫系统的人类miRNA以及其前体、衍生物、变体和模拟物。另外，本专利技术涉及包含所述结合分子、其前体和模拟物的药物和诊断组合物，所述组合物不仅在作为诊断工具用于鉴别与妊娠期间母体免疫系统的调节有关的转录单元的突变方面，而且在如妊娠相关疾病、胎盘形成障碍或问题、自身免疫疾病等与免疫系统误调节或过度活跃相关的病症的治疗策略中或在预防或治疗移植物对抗宿主的反应方面是有价值的。
技术介绍
为了成功怀孕，必需调节母体的免疫系统。已知胎盘的胚胎/胎儿部分，且确切地说是它的滋养层，能够产生可以通过与母体免疫系统局部地(即，在蜕膜内以及在外围)发生相互作用来预防胚胎排斥反应的因子。然而，免疫调节必须在早期妊娠期间就已经有效地发挥作用。在妊娠的前三个月，不少于30%到40%的蜕膜由母体免疫细胞组成，其中大部分(约70%)是NK细胞，但已知巨噬细胞和T细胞也以相当大的百分比存在(Warning等，2011)。 尽管这些介导免疫调节的因子中有一些是已知的，但其它的仍然有待于鉴别。调节母体免疫系统的能力并不限于滋养层，胎儿基质细胞也能够与母体免疫系统的细胞进行有效的交谈(Roelen等，2009)。旨在鉴别负责母体免疫系统的调节的机制的实验似乎指示可溶性因子以及粒子在这个过程中起重要作用。其中后者是可以由多种细胞类型释放的外来体，即，小膜囊，且含有由蛋白质、脂质以及mRNA和miRNA组成的多样性货物蛋白(cargo)(Valadi等，2007)。在妊娠期间，滋养层的细胞可以分泌似乎会抑制母体免疫系统的外来体(Southcombe等，2011)。然而，不知道这种抑制实际上是如何实现的和其中究竟涉及哪些因子。这些因子的鉴别将为妊娠相关病症或妊娠期间的并发症领域内的治疗和诊断策略提供新的手段，并且可能也可用于治疗若干种与免疫系统失调或过度活跃相关的疾病。 已经通过权利要求书中所描绘的和下文所描述的实施方案解决了这一技术问题。
技术实现思路
本文中所提供的数据令人惊讶地突出了 C19MC miRNA在早期妊娠和胎盘基质细胞中的早期功能。这个数据暗示C19MC以及miR-371-3簇的miRNA是重要的免疫调节剂。已经指定编码这两个簇的基因在染色体19的长臂上紧邻彼此(图1)。就本文中所提供的数据而言，本专利技术总体上涉及提供用于免疫调节的C19MC以及miR-371-3簇的miRNA、其前体。就此而言，也提供了共有共同种子序列AAGTGC的其它miRNA和能够干扰这些miRNA分子的靶基因的基因表达的结合分子。此外，本专利技术提供了包含如上文和下文所定义的miRNA分子的核酸序列的核酸、载体和宿主细胞，其中所述核酸序列可操作地连接到调节序列，例如启动子、增强子，所述调节序列用于诱导和控制本专利技术的上述miRNA分子、其前体或其它结合分子在宿主细胞和/或患者中的表达。就此而言，本专利技术还提供了可用于治疗或诊断总体上与免疫系统失调有关联的病症(如同在自身免疫疾病、妊娠相关疾病、胎盘形成或植入障碍或问题的情况下)和治疗或预防同种异体移植物(植入物)的排斥反应或由于移植物对抗宿主的反应所致的病症的药物组合物和诊断组合物。此外，本专利技术还提供了可用于处理被自身免疫疾病侵袭的细胞或者预防或处理例如自身免疫疾病情况下的自体组织破坏现象的药剂。本专利技术所提供的和上述组合物中所使用的药剂是被设计用于不同的施用形式，如局部或全身施用。 【附图说明】 图1:具有两个miRNA簇，即C19MC和miR-371-3的染色体区19ql3的图解 图2:52个胎盘组织中的miRNA miR-520c_3p的相对表达相对于妊娠周数的关系图。 图3:绒膜绒毛的显微解剖图。首先从绒膜绒毛(A)切除基质核心(B)，然后切除滋养层(C)。 图4:以下miRNA在基质和滋养层细胞中的相对表达:miR-371_3p、miR-372、miR-373 和 miR-520c_3p。 图5:miR-520c-3p和miR-517a_3p在蜕膜和滋养层细胞中的相对表达。 图6:说明靶向基因转录物的miRNA充当Fas-FasL诱导的细胞凋亡的抑制剂的的图解。已经根据miRBase (18发行版)鉴别了标靶。 图7:分别在96小时和120小时利用BrdU测定在与JEG-3细胞和bAMC共培养的PBMC中所测量的细胞增殖。 图8:分别在96小时和120小时利用BrdU测定在处于混合淋巴细胞反应中且用Con A刺激的单独PBMC中所测量的细胞增殖。 图9:BC280723的基因组位置。 图10:miR-517a-3p在经编码C19MC的BAC载体转染的牛羊膜源性细胞中在转染后24小时、48小时和6天时与模拟转染(mock transfected)细胞相比的相对表达。对于24小时和6天，进行重复转染。 图11:(A)miR-520c-3p在!1(:1'-116和邛6-3细胞中的相对表达(关于定量RT-PCR的描述，参见实施例1)。(B)分别经JEG-3细胞和HCT-116细胞的上清液处理的Jurkat细胞中的C-FLIP的相对表达。 【具体实施方式】 miR-371-373 (371-3)簇仅含有7个miRNA，而C19MC是目前已知的最大的人类miRNA簇，总共有大约60种不同的miRNA (表1)。已经报告了 C19MC的成员大量地表达于胎盘的滋养层而不是基质部分中，且在妊娠期间的表达有所增加(Luo等，2009)。关于miR371-373簇在胎盘中的表达，对其细节还是未知。 然而，尚未将两个簇的miRNA作为可以调节母体免疫系统的候选物加以论述。反对它们与母体免疫调节有关的有力论据来自于现有文献。首先，C19MC簇成员的表达似乎限于滋养层(Luo等，2009)，但胎盘基质细胞已被描述为也具有免疫抑制功能(Roelen等，2009)。其次，由C19MC簇的miRNA成员的表达增加(Luo等，2009)得出的结论是这些miRNA的功能与妊娠晚期有相当大的关系。 然而，与上文相反，本专利技术内所提供的数据突出了 C19MCmiRNA在早期妊娠和胎盘基质细胞中的早期功能(参见实施例1到4)。就下文更详细描述的这些实验结果而言，与此同时提供了 C19MC以及miR-371-3簇的miRNA作为母体免疫系统的重要调节剂。 由于单一 miRNA能够与超过一个标靶相互作用以及由于miR-371-3和C19MC簇(后者在甚至更大的程度上)中存在多种不同的miRNA，故miRNA的免疫调节功能可能基于多种机制。仅作为一个实例，不希望受理论束缚，实施例8中已经描绘了促细胞凋亡功能，该实施例显示C19MC簇的成员与拮抗Fas-FasL诱导的细胞凋亡的不同mRNA相互作用。然而，其它相关机制，包括诱导细胞衰老以及可逆细胞周期停滞和无反应性，可能也受miRNA影响。因此，关于这些发现的治疗意义，在本专利技术的一个实施方案中，使用本文中所描述的两个簇的单一 miRNA、每单个簇的miRNA以及其不同的组合来满足所预期的治疗目的。 表1:针对染色体带本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于免疫调节的miRNA，其中所述miRNA是选自由C19MC簇或miR‑371‑373簇中所包含的转录单元中的任一个所编码的miRNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.30 EP 11191362.0;2012.04.05 EP 12163414.1;1.一种用于免疫调节的miRNA，其中所述miRNA是选自由C19MC簇或miR-371_373簇中所包含的转录单元中的任一个所编码的miRNA。2.如权利要求1所述的miRNA，其中所述miRNA是选自:具有SEQID No: 1_66的hsa-miR-498、hsa-miR-512_3p、hsa-miR-512_5p、hsa-miR-515_3p、hsa-miR-515_5p、hsa—miR-516a_3p、 hsa-miR-516a_5p、 hsa—miR-5I6b_3p、 hsa-miR-516b_5p、hsa-miR_5I7_5p、hsa_miR-517a_3p、hsa-miR-5I7b_3p、hsa-miR-517c_3p、hsa—miR-518a_3p、hsa—miR-518a_5p、hsa—miR-518b、hsa—miR-518c_3p、hsa—miR-518c_5p、hsa—miR-518d_3p、 hsa-miR-518d_5p、 hsa—miR-5I8e_3p、 hsa—miR-5I8e_5p、hsa-miR_5I8f_3p、 hsa-miR-5I8f_5p、 hsa-miR-519a_3p、 hsa-miR-519a_5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-519e-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f> hsa_miR-520g、 hsa_miR-520h、 hsa-miR-521、 hsa-miR-522_3p、hsa-miR-522_5p、hsa-miR-523_3p、hsa-miR-523~5p> hsa-miR-524_3p、hsa-miR-524_5p、hsa-miR-525_3p、hsa-miR-525_5p、hsa_miR-526a、hsa-miR-526b_3p、hsa-miR-526b_5p、hsa-miR-527、hsa-miR-1283、hsa-miR-1323、hsa-miR-371a_3p、hsa-miR-371a_5p、hsa-miR-371b_3p、hsa-miR-371b_5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373_3p、hsa-miR-373_5p03.如权利要求1或2所述的miRNA，所述miRNA与由C19MC簇或miR-371-373簇所编码的miRNA具有共同种子序列，其中所述miRNA: a.)是选自:具有SEQ ID No: 67-78 的 hsa-miR-302a_3p、hsa-miR-302a_5p、hsa-miR-302b_3p、 h sa-miR-302b_5p、 hsa-miR-302c-3p> hsa-miR-302c_5p、hsa-miR-302d_3p、hsa-miR-302d_5p ;和 / 或 b.)以一致种子序列AAGTGC为特征。4.一种用于免疫调节的miRNA前体，其包含如权利要求1到3中任一项所述的miRNA的核酸序列。5.一种用于免疫调节的结合分子，所述结合分子能够干扰如权利要求1到4中任一项所述的miRNA分子的标靶基因的基因表达，其中所述结合分子是选自用于免疫调节的包含合成miRNA模拟物、RNA分子、抗体、适体、镜像异构体的分子群组。6.一种双链核酸，其包含如权利要求1到4中任一项所述的miRNA或miRNA前体或如权利要求5所述的结合分子的核酸序列。7.—种载体,其包含如权利要求6所述的双链核酸。8.—种宿主细胞，其包含如权利要求7所述的载体。9.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述细胞是人类细胞，优选其中所述细胞是选自患者的自体细胞的群组。10.一种药物组合物或诊断剂，其包含至少一种根据权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子、如权利要求6所述的双链核酸、如权利要求7所述的载体和/或如权利要求8或9所述的宿主细胞作为药剂。11.如权利要求10所述的药物组合物或诊断剂，其中所述活性剂被包埋在人造外来体中。12.如权利要求1到3中任一项所述的miRNA、如权利要求4所述的miRNA前体、如权利要求5所述的结合分子或如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于治疗自身免疫疾病。13.根据权利要求12所述的用途，其中所述自身免疫疾病是选自包括以下的疾病群组:急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜泻、冷凝集素病、克罗恩病、皮肤肌炎、I型糖尿病、子宫内膜异位症、嗜酸性筋膜炎、胃肠道类天疱疮、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)、红斑狼疮、米勒费雪综合征(格林-巴利综合征)、混合结缔组织病、重症肌无力、寻常天疱...

【专利技术属性】
技术研发人员：约恩·布勒尼克，因加·弗洛尔，
申请(专利权)人：不来梅大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE