本发明专利技术公开了一种检测弯曲菌23SrRNA基因突变位点的引物及方法。本发明专利技术提供了检测或辅助检测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的引物组，由特异片段扩增引物对和测序引物组成；所述特异片段扩增引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；所述测序引物为序列表中序列2所示的单链DNA分子。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术提供的用于焦磷酸测序法的引物组及方法，应用简单、反应快速，且可以通过直接测序结果是否有突变而判断待测菌株是否耐红霉素。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种。本专利技术提供了检测或辅助检测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的引物组，由特异片段扩增引物对和测序引物组成；所述特异片段扩增引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；所述测序引物为序列表中序列2所示的单链DNA分子。本专利技术的实验证明，本专利技术提供的用于焦磷酸测序法的引物组及方法，应用简单、反应快速，且可以通过直接测序结果是否有突变而判断待测菌株是否耐红霉素。【专利说明】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的引 物及方法。
技术介绍
嗜热弯曲菌是引起人急性胃肠炎的最重要的食源性致病菌之一，临床上95%以上 的弯曲菌性肠炎都是由空肠弯曲菌和结肠弯曲菌引起。空肠/结肠弯曲菌可通过食物链传 播给人，污染的禽肉、牛奶和饮用水都是主要的传播途径。红霉素是典型的大环内酯类药 物，同时也是临床上针对弯曲菌感染的一线治疗药物，而耐药弯曲菌的出现导致临床上弯 曲菌病病程迁延不愈和治疗失败，极大的威胁人类健康，耐药菌株也导致治疗成本增加等 问题，造成巨大的经济损失。弯曲菌对红霉素表现耐药主要是由核糖体23S rRNA肽酰转移 酶活性中心基因突变所介导。由于弯曲菌含有3个拷贝的核糖体23S rRNA，因此有必要对 耐红霉素弯曲菌核糖体23S rRNA基因的2075位点定量检测。 目前用于检测弯曲菌耐药的方法主要有传统的药物敏感性试验法和基因型突变 检测法，基因型突变检测法主要有聚合酶链式反应线性探针法，聚合酶链式反应限制性片 段长度多态性分析法，错配扩增突变聚合酶链反应法，及荧光定量聚合酶链式反应法等方 法。传统的弯曲菌药物敏感性试验需要进行弯曲菌培养，要求较高的培养条件，需要花费大 量的时间，不满足急性传染病紧急疫情防治工作的需要；以聚合酶链式反应为基础的其他 基因型突变检测方法成本较高，不适宜对大量样品进行检测，而且仅是定性试验，无法进行 点突变基因拷贝数的定量试验。 焦磷酸测序技术是近年发展起来的一种依靠生物发光进行脱氧核苷酸（DNA)序列 分析新技术，它是目前唯一得到定量序列结果的突变检测技术，可达到实时测定DNA的序 列的目的，此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，具有分析结果快速、准确和极高的准 确性，重现性佳，和自动化的特点。是一种通用型技术平台，功能多样，应用领域广泛，具有 高通量、低成本的特点，聚合酶链式反应（PCR)产物即可直接用于测序，不需进行产物二次 处理，操作简便，所需样品量小的特点。在焦磷酸测序检测突变的过程中，对目的片段很好 的扩增和对待测位点的确定是整个实验的关键。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供检测或辅助检测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的引物 组。 本专利技术提供的检测或辅助检测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的引物组，由特异片 段扩增引物对和测序引物组成； 所述特异片段扩增引物对为能特异扩增含有所述弯曲菌23S rRNA基因突变位点 的片段的引物对； 所述测序引物为由15个核苷酸组成的单链DNA分子，所述单链DNA分子的5'端 的3-10个核苷酸与所述弯曲菌23S rRNA基因突变位点前3-10核苷酸相同或互补。 上述引物组中，所述特异片段扩增引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子 和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成； 所述测序引物为序列表中序列3所示的单链DNA分子。 上述引物组中，所述特异片段扩增引物对中序列表中序列2所示的单链DNA分子 的5'末端标记生物素； 所述23S rRNA基因突变位点为23S rRNA基因的第2075位碱基，所述23S rRNA 基因的第2075位碱基为突变碱基G或野生型碱基A ; 所述弯曲菌为空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。 本专利技术的另一个目的是提供检测或辅助检测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的 PCR试剂或PCR试剂盒。 本专利技术提供的PCR试剂，由PCR试剂A和PCR试剂B组成；所述PCR试剂A由上述 的引物组中的特异片段扩增引物对、PCR扩增缓冲液A和水组成； 上述 PCR 扩增缓冲液 A 为 TAKARA 公司的 Premix Ex Taq?Version2. 0 (Loading dye mix, TAKARA 公司，货号是 D336A ; 所述PCR试剂B由上述的引物组中的测序引物、PCR扩增缓冲液B和水组成； 所述引物组中的特异片段扩增引物对中的各条引物在所述PCR试剂A中的终浓度 均为10ρΜ-1 μ M，所述引物组中的特异片段扩增引物对中的各条引物在所述PCR试剂A中的 终浓度均具体为10pM ; 上述 PCR 扩增缓冲液 B 为 annealing buffer (BI0TAGE 公司， Ref40-00361ot610018)。 本专利技术提供的PCR试剂盒，包括上述的引物组或所述PCR试剂； 所述23S rRNA基因突变位点为23S rRNA基因的第2075位碱基，所述23S rRNA 基因的第2075位碱基为突变碱基G或野生型碱基A ; 所述弯曲菌为空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。 上述的引物组或上述PCR试剂或试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测弯曲菌 23S rRNA基因突变位点产品中的应用也是本专利技术保护的范围； 或上述的引物组或上述的PCR试剂或试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测弯曲 菌耐药性中的应用也是本专利技术保护的范围； 所述23S rRNA基因突变位点具体为23S rRNA基因的第2075位碱基，所述23S rRNA基因的第2075位碱基具体为突变碱基G或野生型碱基A ;所述耐药性具体为耐红霉 素；所述弯曲菌具体为空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。 上述产品为试剂盒。 本专利技术的第三个目的是提供一种检测待测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的方法。 本专利技术提供的检测待测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的方法，包括如下步骤： 1)用上述的引物组或上述PCR试剂或试剂盒中的所述特异片段扩增引物对对待 测弯曲菌进行PCR扩增，得到生物素标记的PCR产物； 2)所述生物素标记的PCR产物和抗生物素蛋白的琼脂糖凝胶磁珠（以抗生物素 蛋白的琼脂糖凝胶磁珠的溶液形式存在，每50ul溶液为3 μ L抗生物素蛋白的琼脂糖凝胶 磁珠和47ul的binding buffer的混合溶液）震荡混合(体积比为1:1，25°C)下震荡混合 lOmin)，得到混合产物；抓取所述混合产物中结合琼脂糖磁珠的PCR产物，再进行变性(依 次在70%无水乙醇、0. 2M的NaOH水溶液、10mM的Tris-醋酸中放置)，得到焦磷酸测序单链 模板； 3)将所述焦磷酸测序单链模板与测序引物在测序缓冲液中混匀，经80°C反应 2min后冷却，使单链模板与测序引物结合，设定反应顺序为AGACGATCGATCGATC进行测序， 得到测序产物，实现检测待测弯曲菌23S rRNA基因突变位点； 所述23S rRNA基因突变位点为23S rRNA基因的第2075位碱基，所述23S rRNA 基因的第2075位碱基本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测或辅助检测弯曲菌23S rRNA基因突变位点的引物组，由特异片段扩增引物对和测序引物组成；所述特异片段扩增引物对为能特异扩增含有所述弯曲菌23S rRNA基因突变位点的片段的引物对；所述测序引物为由15个核苷酸组成的单链DNA分子，所述单链DNA分子的5’端的3‑10个核苷酸与所述弯曲菌23S rRNA基因突变位点前3‑10核苷酸相同或互补。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴聪明，汪洋，娜仁高娃，沈建忠，邓凤如，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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