描述了使人们能够特异性测量特定分子在相对较少的细胞(例如原代细胞)中的代谢产物的方法。该方法牵涉任选与标记底物(例如通过13C，15N，或31P标记)一起预先加载细胞。该方法容许不同表型的细胞中差异生成的代谢物的容易鉴定。用于无偏爱的多维NMR筛选和NMR筛选的快速且有效分析的新方法鉴定不同细胞或组织类型中的差异表达的代谢物。对差异表达的代谢物的分析可以呈现可以对其设计小分子治疗剂的独特的可用药靶物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】描述了使人们能够特异性测量特定分子在相对较少的细胞（例如原代细胞）中的代谢产物的方法。该方法牵涉任选与标记底物（例如通过13c，15N，或31P标记）一起预先加载细胞。该方法容许不同表型的细胞中差异生成的代谢物的容易鉴定。用于无偏爱的多维NMR筛选和NMR筛选的快速且有效分析的新方法鉴定不同细胞或组织类型中的差异表达的代谢物。对差异表达的代谢物的分析可以呈现可以对其设计小分子治疗剂的独特的可用药靶物。【专利说明】基于NMR的代谢物筛选平台 关于联邦资助研究的声明 本专利技术在国家健康研究所授予的R21AI087431下在政府帮助下进行。政府具有本 专利技术的某些权利。 专利
本专利技术涉及基于NMR的筛选平台。 专利技术背景 细胞的代谢输出是限定该细胞类型的功能性基因组，转录物组和蛋白质组网络的 总和。代谢物组学是代谢物组中的代谢物水平及其由于刺激物而随时间变化的全面且同 时的系统性测定。虽然其它领域可以提供关于例如给定基因，mRNA或蛋白质的拷贝数的信 息；但是牵涉代谢物的化学过程的此研究提供了所有异常基因，RNA，和/或蛋白质的下游 总和。此"代谢指纹"代表特定细胞类型中所有运行或非运行途径的瞬象。 已经使用几种分析方法，包括质谱术，层析，和NMR分光术来量化细胞代谢物。质 谱术和层析两者需要较小的样品量，并且可以容易适合于高通量分析；然而，这两种方法都 通常牵涉至少一个（若不是几个）纯化步骤。此外，在大多数情况中，要检查的代谢物必须 推理预选择。非祀向质谱术（untargeted mass spectrometry)方法是可能的，但是需要几 轮纯化和进一步鉴定方法。另外，不是所有代谢物，包括核苷酸类类似物和脂质是容易可电 离的，因此不能通过质谱术检测。此外，源自质谱术的片段化样式不总是适合于区别诸如具 有相等质量，但不同结构的糖等分子，因此限制分析。 专利技术概述 本文中描述了一种快速的，无偏爱的，超高分辨率，定量NMR筛选平台，其利用任 何组合的下列任一种，两种，三种，四种，或所有五种技术：底物的稳定同位素标记，光谱 宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展，以产生定制的 "NMR代谢物阵列"，其中将给定细胞样品的所有已知代谢物的共振分类，并用于简化统计学 分析的比较。这是第一次组合所有这些技术来提供稳健的，有效的且高通量的NMR代谢物 筛选方案。步骤的组合容许水溶性和基于脂质的代谢物两者的全局的，无偏爱的，超高的分 辨率。另外，本文中描述的新颖"NMR代谢物阵列"程序提供了以简化方式分析较大的复杂 NMR数据集的新方式。该新平台同时容许差异表达的代谢物的快速鉴定，特定代谢物的量 化，和分析给定前体的代谢流量的能力。 新方法使人们能够特异性追踪特定分子在相对较少的细胞（例如约200-2000万 个细胞）中的代谢分解。该方法牵涉与经标记前体底物（例如用 13C，或15N，或31P标记）一 起预先加载细胞，并使用多维NMR。该方法不需要在分析前纯化感兴趣的各个代谢物，所述 分析容许具有不同特性的细胞中差别生成的代谢物的全局，无偏爱鉴定。 正常和疾病状态细胞中差异表达的代谢物的鉴定可以是临床上的一种有力的工 具。用于监测来自表型上不同的细胞的代谢物的差异表达的新方法特别可用于鉴定可以用 于调控表型的治疗性靶物。这包括存在于代谢物的生物合成途径中的靶物，或代谢物自身。 此外，鉴定差异表达的代谢物可以用于区别正常对疾病状态的细胞。因此，它们具有充当与 其关联的表型的生物标志物的潜力，使本文中描述的方法可用于鉴定诊断标志物，例如用 于诊断疾病的标志物。 另外，本文中描述了我们鉴定N-乙酰神经氨酸（NANA)作为乳腺癌肿瘤启动细胞 的新颖生物标志物，并且监测其表达可以用于诊断和检测乳腺癌。另外，显示了 CMAS(NANA 生物合成中的一种酶）的蛋白质水平在乳腺肿瘤启动细胞中显著过表达。在此工作前，尚 未探索CMAS在肿瘤启动和转移中的作用。在本文中，我们提供了如下的证据，即CMAS表达 对于肿瘤形成和迁移是绝对重要的，且CMAS是乳腺癌的一种新颖的真正靶标。 对个别患者的细胞分析应用此方法还会为用于患者护理的"个人化医学"方法提 供基础。 因而，本公开内容描述了用于监测细胞群体，例如原代细胞群体，组织细胞群体， 或培养细胞（例如永生化细胞）内的给定底物前体的代谢的方法。描述了使用本文中描述 的方法鉴定具有不同表型的两种或更多种细胞群体间的差异表达代谢物。还描述了用于鉴 定潜在的治疗靶物和诊断标志物的方法。 一般而言，在第一个方面，公开内容特征在于在样品中监测给定类型细胞内的底 物代谢的新方法。该新方法包括（a)用底物将第一样品的给定类型细胞培养足够的时间 段，使得容许所述底物代谢分解成底物代谢物，其中任选地用核磁共振（NMR)稳定同位素 标记所述底物的至少一部分；(b)从步骤（a)的细胞收获所述底物代谢物以获得底物代谢 物的第二样品；并（c)对步骤（b)的所述第二样品实施多维NMR以测定代谢底物的共振谱 (resonance spectrum)，其中所述共振谱代表所述底物的代谢物，且其中所述多维NMR包含 下列任一种技术：光谱宽度折叠 （spectral width folding)，随机相取样（random phase sampling),非均勻取样（non-uniform sampling),和增强动态范围数据重建的数据扩展 (data extension for enhanced dynamic range data reconstruction)〇 在另一个方面，公开内容特征在于用于鉴定第一细胞群体和第二细胞群体之间的 差异表达的底物代谢物的方法。这些方法包括（a)任选地，与核磁共振（NMR)稳定同位素 标记底物一起加载第一和第二细胞群体；(b)将步骤（a)的所述第一和第二细胞群体培养 足够的时间段，使得容许所述底物向底物代谢物的代谢分解；（c)从步骤（b)的所述第一和 第二群体细胞收获所述底物代谢物以从所述第一和第二细胞群体中每种获得底物代谢物 的样品；（d)对所述第一和第二细胞群体中每种的步骤（c)的样品实施多维NMR以测定所 述第一细胞群体和所述第二细胞群体的代谢底物的共振谱，其中所述共振谱代表所述底物 的代谢物；并（e)比较所述第一细胞群体的共振谱与所述第二细胞群体的共振谱以测定哪 些共振是差异表达的，其中差异表达的共振提供代表差异表达的代谢物的共振标记。 在这些方法之任一种中，多维NMR可以包括任何组合的下列任两种，三种，或所有 四种技术：光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重建的数据扩展。 在这些方法之任一种中，底物可以用NMR稳定同位素标记，且多维NMR可以包括任何组合的 下列任两种，三种，或所有四种技术：光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态 范围数据重建的数据扩展。 在这些方法的一些实施方案中，没有将存在于所述样品中的所述底物代谢物与所 述样品中的其他分子分开。在一些实施方案中，在与NMR标记底物一起加载细胞前将细胞 群体内的底物浓度降低一段时间，并使用为所述底物定制的NMR脉冲程序或过滤技术或两 者测定经标记的底本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于在样品中监测给定类型细胞内的底物代谢的方法，该方法包括：a.用底物将第一样品的给定类型细胞培养足够的时间段，使得容许所述底物代谢分解成底物代谢物，其中任选地用核磁共振(NMR)稳定同位素标记所述底物的至少一部分；b.从步骤(a)的细胞收获所述底物代谢物以获得底物代谢物的第二样品；并c.对步骤(b)的所述第二样品实施多维NMR以测定代谢底物的共振谱(resonance spectrum)，其中所述共振谱代表所述底物的代谢物，且其中所述多维NMR包含下列任一种技术：光谱宽度折叠(spectral width folding)，随机相取样(random phase sampling)，非均匀取样(non‑uniform sampling)，和增强动态范围数据重建的数据扩展(data extension for enhanced dynamic range data reconstruction)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：EM奥戴，J利伯曼，G瓦格纳，
申请(专利权)人：儿童医疗中心公司，哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：美国;US
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